12種中藥對(duì)20株廣泛耐藥銅綠假單胞菌的體外抑菌作用研究

黃曉輝 高貴陽(yáng) 黃志昂

全世界范圍內(nèi)抗生素濫用情況十分嚴(yán)峻, 我國(guó)是抗生素使用率最高的國(guó)家［1］。細(xì)菌耐藥是抗菌藥物濫用的必然結(jié)果,近年來(lái)我國(guó)耐藥菌甚至泛耐藥菌感染越來(lái)越常見(jiàn), 檢出率不斷上升［2］。銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性桿菌, 廣泛存在于自然界和人體中, 是導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要病原菌之一, 中草藥因?yàn)榫哂胁涣挤磻?yīng)小、資源豐富、價(jià)格低、作用位點(diǎn)相對(duì)較多, 不易產(chǎn)生耐藥等特點(diǎn)越來(lái)越受到藥學(xué)和病原微生物研究者的關(guān)注［3,4］。本研究通過(guò)對(duì)魚腥草等12種中藥進(jìn)行體外抑菌活性研究, 以篩選出來(lái)活性較好的中藥, 為深入研究其活性化合物和作用機(jī)制打下物質(zhì)基礎(chǔ), 為中藥擇優(yōu)組方應(yīng)用提供數(shù)字依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取2017年4~11月本院呼吸內(nèi)科、重癥監(jiān)護(hù)室、普外科患者的痰液、尿液、傷口分泌物分離所得廣泛耐藥銅綠假單胞菌(MDR-PA)20株(MDR菌株參照文獻(xiàn)［5］的判斷標(biāo)準(zhǔn))(質(zhì)控菌株為ATCC27853, 廣東省臨檢中心)；中藥：魚腥草、五味子、黃連、黃芩、連翹、黃柏、金銀花、虎仗、苦參、穿心蓮、麻黃、夏枯草, 由榕城區(qū)中心醫(yī)院中藥房提供并鑒定, 參考穆廷杰等［6］的中藥原液制備方法。儀器及設(shè)備：細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀TDR-1002及其配套試劑購(gòu)于汕頭康林醫(yī)藥有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn) 首先用TDR-1002對(duì)臨床菌株進(jìn)行鑒定和初步藥敏試驗(yàn), 并且用紙片擴(kuò)散(K-B)法確認(rèn)收集菌株對(duì)臨床常用15種抗菌藥物的敏感性, 藥敏結(jié)果判斷參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2013年標(biāo)準(zhǔn)［7］, 質(zhì)控菌株為ATCC27853。

1. 2. 2 12種中藥的MIC測(cè)定 水煎液試管稀釋法測(cè)定MIC,均按照CLSI2013版指南進(jìn)行, 中藥抗菌實(shí)驗(yàn)采用中藥抗菌實(shí)驗(yàn)試管法, 參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。

1. 2. 3 菌株編號(hào) 將從12種中藥篩選出來(lái)的20株MDRPA分別以(S+數(shù)字)予以編號(hào), 分別是S1, S2, S3.......S20。

1. 3 觀察指標(biāo) 肉眼觀察測(cè)試管濁度, 每個(gè)測(cè)試管與對(duì)照管比較, 直至測(cè)試管與陰性對(duì)照管濁度相當(dāng), 則認(rèn)為該管細(xì)菌未被抑制, 該測(cè)試管藥物濃度代表該中藥MIC。

2 結(jié)果

2. 1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 20株MDR-PA對(duì)臨床15種抗生素藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果, 見(jiàn)表1。

2. 2 MIC檢測(cè)結(jié)果 魚腥草, 黃連, 黃芩, 黃柏, 夏枯草對(duì)20株MDR-PA有不同程度的體外抑菌作用, 其他7種中藥MDR-PA對(duì)體外無(wú)抑菌作用, MIC均值分別為38.71、54.72、39.10、38.90、47.70 mg/ml, 和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853的MIC接近, 魚腥草的體外抑菌作用最強(qiáng)。見(jiàn)表2。

表1 20株MDR-PA對(duì)抗生素的藥敏情況［n(%)］

表2 12種中藥對(duì)MDR-PA的MIC值檢測(cè)結(jié)果(mg/ml)

3 討論

隨著抗生素藥物的濫用, 目前抗生素治療效果很差。從中藥中發(fā)現(xiàn)新的有效化學(xué)成分已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。中藥的確有抗菌、延緩、消除細(xì)菌耐藥性的作用［9,10］。在醫(yī)院內(nèi)感染中, 革蘭陰性菌的檢出率明顯高于革蘭陽(yáng)性菌,而且銅綠假單胞菌的檢出率在革蘭陰性菌中位于首位［11］,因此革蘭陰性菌感染在臨床上是急待解決的問(wèn)題。近年來(lái),PA廣泛耐藥性的產(chǎn)生給臨床感染治療帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)。武曉敏等［12］通過(guò)對(duì)臨床分離的711株MDR-PA的耐藥性分析和分布情況分析, 發(fā)現(xiàn)這711株菌株對(duì)頭孢唑啉、復(fù)方新諾明、頭孢呋辛酯、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、呋喃妥因、頭孢呋辛耐藥率達(dá)95.00%, 并且這711株菌株中, 89.59%來(lái)源于痰標(biāo)本。由此可見(jiàn)呼吸道感染的高發(fā)病率, 因此研究中藥及其活性成分對(duì)MDR-PA體外抑菌作用具有較大的臨床意義。

清熱解毒類中藥(如黃連、黃芩、黃柏等)具有抗菌活性高、毒性低、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn), 但目前中藥對(duì)耐藥菌發(fā)揮作用的機(jī)制尚不明確, 魚腥草是三白草科植物, 主要抑菌成分是魚腥草素, 其具有清熱解毒、消癰排膿等作用［13-16］。魚腥草素鈉可通過(guò)抗生物被膜的活性從而起到抗菌的作用［14］, 也證實(shí)了作者的推測(cè)。夏枯草為唇形科植物,主要活性成分有萜類、甾體類、黃酮類、香豆素類等, 其味苦、性寒、辛, 具有清熱解毒、清肝明目、抗炎解熱、鎮(zhèn)痛作用,水溶部分能抑制部分細(xì)菌生長(zhǎng)［15-18］。

本次研究結(jié)果顯示, 魚腥草、黃連、黃芩、黃柏、夏枯草對(duì)20株MDR-PA有不同程度的體外抑菌作用, 其他7種中藥MDR-PA對(duì)體外無(wú)抑菌作用, MIC均值分別為38.71、54.72、39.10、38.90、47.70 mg/ml, 和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853的MIC接近, 魚腥草的體外抑菌作用最強(qiáng)。表明了魚腥草等5種常見(jiàn)的中藥對(duì)MDR-PA均有體外抑菌作用, 其中魚腥草對(duì)MDR-PA表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果, 可在相對(duì)較低的水煎液濃度下抑制MDR-PA生長(zhǎng)。抗生素藥物敏感性試驗(yàn)絕大部分早已有國(guó)際通用的指南和標(biāo)準(zhǔn), 但是細(xì)菌對(duì)中藥的敏感性試驗(yàn)檢測(cè)一直無(wú)明確國(guó)際標(biāo)準(zhǔn), 《藥典》中雖有關(guān)于中藥K-B法檢測(cè)方法, 不過(guò)其判斷標(biāo)準(zhǔn)非常簡(jiǎn)單, 并且對(duì)所有中藥及細(xì)菌都是一個(gè)耐藥標(biāo)準(zhǔn), 顯然不符合藥物和細(xì)菌特性［19-27］,更困難的是目前尚沒(méi)有中藥對(duì)PA的實(shí)際效果標(biāo)準(zhǔn), 因此,本試驗(yàn)只是為中藥在體外對(duì)MDR-PA證實(shí)存在抑制作用提供初步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 在人體內(nèi)是否有效, 需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體試驗(yàn)等方法來(lái)確定, 不斷創(chuàng)新與開(kāi)拓, 才能使中藥更好地造福于人類健康。