傳統調味品中納豆激酶產生菌的篩選和鑒定

王俊芳，劉佳佳，劉佳音

(1.河南大學 生命科學學院，河南 開封 475004；2.河南大學 健康與護理學院，河南 開封 475004)

納豆是將黃豆蒸煮過后，在納豆枯草芽孢桿菌的發酵作用下制成的，是一種具有粘性、口感潤滑、營養成分極豐富的豆制品，其營養價值較大豆倍增[1,2]。研究表明，納豆發酵過程中納豆菌產生了一種能夠直接溶解纖維蛋白的堿性絲氨酸蛋白酶活性物質，即納豆激酶(nattokinase)。納豆激酶是日本科學家須見洋行從納豆中首先發現并命名的，因其顯著的溶血栓作用而備受矚目[3]。納豆激酶的溶血栓能力明顯強于尿激酶、鏈激酶、t-PA、蛇毒制劑、DSPA等具有一定副作用的溶血栓藥物。納豆激酶作用迅速，使用安全，無毒副作用，半衰期長，具有廣闊的開發和應用前景。隨著血栓類疾病對人類健康的危害日益加重，人們開始注重養生，食用納豆激酶保健品的人們越來越多。而納豆作為調味品，具有預防心腦血管疾病、抗氧化、降血壓、抗癌、防治骨質疏松、美容等保健功能[4-6]。由于購買的商品納豆大多都有胺臭味，聞起來有點讓人難以接受。因此，本文旨在對納豆激酶產生菌進行篩選、鑒定，以獲得符合國人口味的醬香型發酵納豆生產用菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

自制豆豉、豆醬等發酵豆制品。

1.1.2 主要試劑

凝血酶(1000 U)、纖維蛋白原、尿激酶(≥7200 U)：均購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑：均為市售分析純。

1.1.3 培養基

斜面培養基為LB培養基[7]：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，用來活化及保藏菌種。

初篩選培養基(牛奶平板)：用來篩選產蛋白酶的菌株，配制方法是向配好的牛肉膏蛋白胨培養基中添加終質量濃度為15 g/L的牛奶，溫度105 ℃，時間30 min，單獨滅菌。

液體發酵培養基為牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，用于菌種的發酵培養。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

將不同的豆豉、豆醬等樣品各取5 g，分別加入裝有20 mL無菌水和10顆玻璃珠的錐形瓶中，在溫度30 ℃，轉速200 r/min下振蕩20 min，再于室溫下浸提1 h，轉速3000 r/min離心5 min，即制得菌懸液。

1.2.2 納豆激酶生產菌株的篩選

1.2.2.1 初篩

將制得的菌懸液于80 ℃水浴鍋中熱處理20 min，再將不同樣品制得的菌懸液用生理鹽水倍比稀釋，取10-1，10-2，10-3，10-44個濃度梯度，分別取100 μL涂布牛奶平板，在30 ℃恒溫箱培養18 h。

1.2.2.2 復篩

觀察牛奶平板上長出的單菌落，選出透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株，用無菌牙簽接種到牛奶平板上。放入30 ℃恒溫培養24 h，再次選出透明圈比值較大的菌株。將篩選出的菌分別在牛肉膏蛋白胨培養基上連續劃線分離純化，重復篩選3次。

挑取純化的單菌落，接種到LB斜面培養基，30 ℃恒溫培養24 h，放入4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 納豆激酶酶活分析

1.2.3.1 制備納豆激酶粗酶液

將篩選得到的高產菌株用無菌牙簽挑取，分別接種到30 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在全溫度振蕩培養箱中在30 ℃，轉速200 r/min的條件下搖床培養22 h。取出后在4 ℃，轉速12000 r/min下離心10 min，取其上清液，即得到納豆激酶粗酶液。

1.2.3.2 配制改良的纖維蛋白原平板

參考Astrup等的方法[8]：利用瓊脂糖、凝血酶和纖維蛋白原按比例混合制成人工血栓平板：配制瓊脂糖溶液：將0.1 g的瓊脂糖加入到10 mL蒸餾水中，用微波爐加熱使之溶解，在121 ℃滅菌20 min，使用前在45 ℃下恒溫水浴10 min；配制纖維蛋白原溶液：將0.01 g纖維蛋白原加入到10 mL 10 mol/L的PBS緩沖液中(pH為7.44)，振蕩搖勻后在45 ℃下恒溫水浴10 min備用；將凝血酶稀釋至100 U/mL，取10 μL加入到配制好的瓊脂糖溶液中，快速搖晃均勻，倒入9 cm的無菌平板中，在室溫下放置一段時間使其充分冷卻凝固。

1.2.3.3 制作尿激酶標準曲線

參考張杰等描述的尿激酶標準曲線的制作方法[9]。首先將尿激酶標準品稀釋至50，200，400，600，800，1000 U/mL，分別取10 μL上樣于配制好的均勻擺放了牛津杯的纖維蛋白平板上，在室溫下靜置10 min，于37 ℃恒溫培養箱中培養18 h，取出后用游標卡尺測量各個溶解圈的直徑，計算出各個溶圈的面積。將尿激酶的酶活力單位數作為橫坐標，將溶解圈的面積作為縱坐標，做標準曲線。

1.2.3.4 納豆樣品酶活檢測

加樣：將滅過菌的牛津杯均勻放置在纖維蛋白平板上，加入10 μL納豆激酶粗酶液，在室溫下靜置10 min后放入37 ℃恒溫培養箱中培養18 h。

觀察溶解圈的大小，測量其直徑，計算溶解圈面積。對照尿激酶標準曲線計算樣品的酶活。

1.2.4 納豆激酶產生菌生長曲線的測定

將篩選出的納豆激酶產生菌接種到牛肉膏液體培養基中，放入37 ℃，200 r/min的搖床中培養，每隔2 h測量其OD595值，重復測量3次。將OD595值作為縱坐標，生長時間作為橫坐標，做出納豆激酶產生菌的生長曲線。

1.2.5 納豆制備及其感官評價

從本實驗篩選出的納豆菌株中，挑選出纖溶活性較好的菌株，另外，再以枯草芽孢桿菌1-44菌株作為對照，分別制備待發酵菌株的種子液，4 ℃冰箱保存備用。

挑選大小相對一致、無蟲咬和顆粒飽滿的大豆。將大豆清洗干凈，以3∶1的比例加入水，在室溫下浸泡18 h，將水過濾掉，分裝到250 mL的錐形瓶中，40 g/瓶，放入高壓蒸汽滅菌鍋，121 ℃下蒸煮30 min。取出后冷卻至50 ℃左右，加入2 mL菌懸液，充分混勻，在37 ℃下恒溫發酵24 h，發酵完成后放入4 ℃冰箱中，后熟24 h后即得到納豆制品。

將制得的納豆轉移到培養皿中，攪拌均勻后測定其拉絲長度。具體方法是用玻璃棒挑起，以20 cm作為1個單位，拉出20 cm后再從中間挑起20 cm，重復至拉斷為止。另外，對納豆的氣味、口感、色澤、拉絲和納豆激酶酶活等指標分別進行感官評價。評價方式參考馬明等的方法進行[10]。品評人數為10人，分別對納豆單項指標進行打分，并綜合評價。

1.2.6 納豆激酶產生菌的鑒定

1.2.6.1 形態觀察和生理生化鑒定

參照東秀珠《常見細菌鑒定手冊》，對篩選得到的納豆激酶生產菌進行形態特征和生理生化鑒定實驗[11]。

1.2.6.2 PCR檢測

PCR產物由上海生工擴增及測序。提取目標菌株基因組，并以其為模板，采用細菌16Sr DNA通用引物F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增，PCR擴增體系為：ddH2O 15.9 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+(1.5 mmol/L)1.5 μL，dNTP (10 mmol/L)2.0 μL，P1 (10 mmol/L)1.0 μL，P2 (10 mmol/L) 1.0 μL，模板1.0 μL，rTaq酶0.1 μL，PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.2.6.3 16S rDNA 測序及同源性分析

測序結果在RDP 網站(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)數據庫檢出與所測菌16S rDNA 序列同源性較高的序列，判斷16S rDNA 基因鑒定結果。

1.2.6.4 系統發育分析

在RDP 核苷酸數據庫中挑選出同源性較為相近的16S rDNA 序列，用MEGA 7.0軟件鄰接法(neighbor-joining method)進行1000次步長計算，構建系統發育樹。

1.2.7 不同培養條件下對納豆激酶產生菌的酶活測定

分別在不同的初始pH值和發酵溫度下，針對篩選出的纖維活性最高的菌株，進行發酵產酶的實驗，觀察這些培養條件對產納豆激酶的影響，實驗設計如下：

(1)將250 mL的瓶分裝30 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基，初始pH分別調為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，接種高產菌后于37 ℃，轉速200 r/min下搖床發酵24 h，測其OD595值及相對酶活。

(2)將高產菌接種到pH和鹽離子都一定的液體培養基中，分別放在25，28，35，37，40 ℃幾個不同溫度下發酵，24 h后分別測量其相對酶活，觀察溫度對產酶的影響。

(3)在配制液體培養基時，將牛肉膏培養基中原本單一的Na+換成用Mg2+，K+，Ca2+，Mn2+分別與Na+按一定比例組合加入，鹽離子加入量為0.2 g/L，pH都調為7，分裝成30 mL/瓶，接種高產菌，培養條件及酶活測定方法同(1)，比較各離子對產酶的影響。

1.3 數據分析

實驗重復3次及以上，數據采用平均值，數據經方差分析，計量數據組間比較利用Duncan檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 納豆激酶生產菌株的篩選

利用牛奶平板對產酶菌株進行初篩選，共選出15株纖溶性明顯的菌株。測量這些菌株的透明圈直徑和菌落直徑，并計算其比值。通過計算從中挑選出4株直徑比較大的菌株，結果見圖1。各菌株周圍均有明顯的透明圈，N-2菌株的直徑比最大，高于枯草芽孢桿菌1-44和1-37菌株的直徑比。

圖1 牛奶平板初篩納豆激酶產生菌Fig.1 Screening nattokinase producing strains in milk plate

2.2 納豆激酶酶活分析

通過測量尿激酶標準品的酶活，制得的尿激酶標準曲線見圖2，得到線性回歸方程：y=0.320x+54.13，R2=0.994，表明線性關系良好。

圖2 尿激酶標準曲線Fig.2 Urokinase standard curve

將測得的溶解圈面積對照尿激酶標準曲線，計算可得。本實驗從豆制品分離篩選出的幾株纖溶性好的菌種中，N-2菌株的酶活力最高，達到了1159 U/mL，結果見表1。

表1 不同菌株納豆激酶酶活Table 1 Nattokinase activity of different strains U/mL

2.3 納豆激酶產生菌生長曲線的測定

納豆激酶產生菌N-2的生長曲線見圖3，N-2菌在0～8 h時生長緩慢，處于生長延滯期；在8～12 h時活菌數量快速增加，處于對數生長期；在12～24 h處于生長穩定期；24 h之后進入生長衰亡期。

圖3 N-2菌株生長曲線Fig.3 Growth curve of N-2 strain

2.4 納豆制作及感官評價

分別利用N-1，N-2，N-3，N-4，1-44菌株發酵制備納豆。并按照相應的評價指標對大豆進行品評打分，比較結果見圖4。

圖4 不同菌株發酵納豆指標比較Fig.4 Comparison of the indexes of natto fermented by different strains

結果顯示：N-2菌株發酵納豆拉絲、口感和氣味等指標都優于其他菌株；1-44菌株發酵納豆色澤黃褐色，半透明狀，優于其他菌株；其中用N-2菌株發酵制得的納豆拉絲長度為80 cm，且醬豆味更香濃；用1-44菌株發酵的納豆拉絲長度為30 cm，香味也稍次于N-2菌株發酵的納豆。通過對發酵納豆綜合評價，N-2優于其他菌株。

N-2發酵結果及拉絲見圖5，N-2發酵制得的納豆初始為黃褐色，后熟結束顏色稍變深，口感酥軟，帶有獨特的醬香味，沒有胺臭味，攪動納豆時其表面的乳白色粘液增多，可以拉出長長的強韌不易斷的拉絲。

圖5 N-2菌株發酵的納豆Fig.5 Natto fermented by N-2 strain

注：左圖為三角瓶發酵納豆；右圖為納豆拉絲。

2.5 高產納豆激酶產生菌的鑒定

2.5.1 形態觀察

N-2菌株的菌落形態近似圓形，邊緣不整齊或裂成葉狀，乳白色不透明，且表面有褶皺。對N-2菌株進行芽孢染色觀察，顯微觀察結果見圖6，菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，產芽孢，芽孢呈柱狀或橢圓形，芽孢中生，芽孢囊不明顯膨大；革蘭氏染色陽性。

圖6 N-2菌株革蘭氏染色Fig.6 Gram's stain of N-2 strain

2.5.2 生理生化鑒定

對N-2菌株的部分生理生化特征進行測定，結果見表2。

表2 N-2菌株生理生化測定Table 2 Physiological and biochemical determination of N-2 strain

2.5.3 N-2菌株16S rDNA同源性分析

將N-2菌株16S rDNA測序結果在RDP 數據庫進行比對，利用Classifier功能比對，結果顯示：N-2菌株屬厚壁菌門，類桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬；通過Seqmatch功能，將16S rDNA測序結果提交比對，結果顯示：N-2菌株與GenBank中的模式菌株解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensDSM7同源性達到99%。

2.5.4 系統發育分析

根據Seqmatch比對結果，選擇與N-2菌株同源性較高的模式菌株16S rDNA 序列，用軟件MEGA 7.0鄰接法(neighbor-joining method)進行1000次步長計算，構建系統發育樹(見圖7)。在該系統發育樹上可見，N-2與GenBank中模式株BacillusamyloliquefaciensDSM7和BacillusamyloliquefaciensNBRC聚在同一個分支，驗證可信度達89%。由以上分析可知，N-2是一株Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)。

圖7 N-2菌株系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree of N-2 strain

注：樹枝上的數值為驗證可信度；圖下端標尺表示堿基置換頻率；上標T表示菌株為模式菌株。

2.6 納豆激酶產生菌N-2菌株培養條件對酶活性的影響

2.6.1 培養基初始pH值對納豆激酶活性的影響

培養基不同初始pH，搖瓶發酵24 h后，分別測量相對酶活，結果見圖8。培養基初始pH值為6.0時的相對酶活最高，pH值為9時相對酶活最低。經方差分析，培養基5個不同初始pH值，發酵結束后，酶活差異極顯著。經多重比較，Duncan檢驗分析，結果顯示：初始pH值為6的培養基發酵結束酶活極顯著高于其他處理；pH值為5的培養基發酵結束酶活顯著高于pH值為9的培養基；其他初始值之間發酵結束兩兩比較，均顯示酶活差異極顯著。

圖8 培養基初始pH對N-2菌株納豆激酶酶活的影響Fig.8 Effect of initial pH of culture medium on nattokinase activity of N-2 strain

注：小寫字母表示顯著度為P<0.05；大寫字母表示顯著度為P<0.01，下同。

2.6.2 發酵溫度對納豆激酶活性的影響

N-2菌株經5個不同的培養溫度，分別培養發酵24 h，實驗結果見圖9。35 ℃時的相對酶活最高，25 ℃發酵相對酶活最低。經方差分析，5個培養溫度經發酵24 h后，25 ℃與40 ℃發酵結束，酶活差異不顯著；28 ℃與40 ℃發酵結束，酶活差異顯著；35 ℃和37 ℃溫度與其他發酵溫度相比，均顯示酶活差異極顯著。

圖9 發酵溫度對N-2菌株納豆激酶酶活的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on nattokinase activity of N-2 strain

2.6.3 不同鹽離子對納豆激酶活性的影響

N-2菌株以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎培養基，分別添加一定量鹽，培養發酵24 h，實驗結果見圖10。與其他鹽相比，Ca2+對產酶的影響效果極顯著，其他鹽之間對產酶的影響效果不顯著。

圖10 鹽離子對N-2菌株納豆激酶酶活的影響Fig.10 Effect of salt ions on nattokinase activity of N-2 strain

對以上實驗結果進行分析，初步確定較佳的培養條件為：培養基初始pH 6.0，加入適量Ca2+鹽，發酵溫度35 ℃。在此培養條件下使用N-2菌進行液體發酵產酶，測得菌液的酶活為1365 U/mL。

3 討論

本實驗從傳統調味品中分離納豆激酶產生菌，對篩選出的幾株纖溶活性高的菌株進行了納豆發酵，并對納豆進行了評分比較。其中，N-2菌株各指標綜合評價分值最高，該菌株發酵納豆性狀較優。發酵初始pH及供氧對納豆激酶酶活影響極顯著。可通過改變培養條件和培養基營養組成優化產酶條件，提高納豆激酶酶活。另外，可通過誘變或基因工程方式對菌種進行選育，提高納豆激酶產量。

市售納豆及納豆激酶存在的突出問題：大多市售納豆都有稍許胺臭味，有少部分人能接受食用；納豆和納豆激酶產品牽涉到納豆激酶酶活，其產品的貨架期相對其他調味品或保健品的貨架期短；菌株納豆激酶產量低。該實驗進一步的研究內容主要從以下幾個方面著手，納豆發酵優化、延長產品的貨架期和提高N-2菌株的產酶量等方面。

4 結論

本實驗從傳統豆豉中篩選出的納豆激酶產生菌編號為N-2的菌株，對其進行形態觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析等項目的測定；鑒定結果初步認定該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。N-2菌株纖溶活性高，其納豆發酵性狀最佳，納豆拉絲長達80 cm，其酶活達到1159 U/mL，該菌最適的單因素液體發酵條件為：培養基初始pH 6.0，添加0.02%濃度的 Ca2+鹽，發酵溫度35 ℃。在該條件下進行液體發酵，其酶活為1365 U/mL，酶活比之前提高了18%。解淀粉芽孢桿菌是公認的益生菌，而且該菌株又來源于食品，因此，N-2菌株可用于保健豆豉和納豆的生產和開發，但作為納豆激酶生產菌商品開發，該菌株的酶活有待進一步提高。