日本無刺花椒風味物質的分析研究

何祖新，祝磊，黎江華，彭偉，魏大能，吳純潔*

(1.四川得恩德藥業有限公司，四川 綿陽 621100；2.成都中醫藥大學 藥學院，成都 611137)

花椒系蕓香科花椒屬植物，因其獨特的“麻辣鮮香”被用來作為食品調味料，也被譽為中國“八大味”之一，在川渝地區更是麻辣味川菜、涼菜及火鍋中必不可少的調味品?；ń分饕t花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)、青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. Et Zucc.)和竹葉椒(ZanthoxylumarmatumDC.)[1]，主要的商品有紅花椒、青花椒、藤椒等。花椒既是香料，也是藥用經濟作物。近年來，各地在農業產業結構調整、新一輪退耕還林及脫貧攻堅等實施過程中，將花椒作為主要經濟作物之一，其種植面積與產量得以迅速增加，并形成了以陜西(韓城)、甘肅(武都)、山東(泰安)、四川(漢源、金陽、茂汶、三臺、洪雅等)、重慶(江津)、云南(昭通)等省市為核心區域的全國聞名花椒基地[2]。四川作為花椒的重要產區，已出臺相關扶持政策，明確到2020年打造成為全國“花椒產業第一省”[3]。

目前，四川省栽培的“漢源花椒”、“大紅袍”、“九葉青花椒”、“藤椒”等知名品種均為傳統品種，枝條有較多的刺，采摘用工多，還經常刺傷手指，制約了規?；l展[4]。日本無刺花椒的果皮、青果、嫩芽、種子等具有重要的應用價值，并因無刺或少刺，采摘方便，較國內花椒能節約大量管理用工，極具生產栽培價值[5,6]。1994年開始，日本金村醫藥株式會社有關專家開始在國內深圳、四川、河南、河北分別試栽日本花椒(山椒)，但嫁接成活率不高[7]。其后，河北、四川、貴州等省林科院及甘肅隴南市農科所等科研院所對日本無刺花椒引進和培育做了大量研究工作，也培育出部分自己的無刺品種[8]。日本無刺花椒的開發利用已成為目前研究的重點，但主要集中在其品種選擇、苗木快繁培育、栽培、經營管理、病蟲害防治等方面，而對于其“香”、“麻”的重要評價指標(風味特征)的研究較少。因此，本文采用HS-SPME-GC-MS和HPLC技術分別對日本無刺花椒的香味物質和麻味物質進行定性、定量分析，以期為后續日本無刺花椒的開發利用、質量標準及品質評價提供參考，并為四川花椒產業的發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟期日本無刺花椒：來源于四川省引種栽培的日本無刺花椒(朝倉山椒)，由廣元市昭化區太公鎮日本無刺花椒種植基地提供。

羥基-α-山椒素對照品、羥基-β-山椒素對照品、羥基-γ-山椒素對照品：自制，純度均大于98%；甲醇(分析純)：成都科龍試劑廠；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)：美國Sigma-Aldrich公司；水為自制去離子水。

1.2 儀器與設備

GC-MS-TQ8040氣相色譜-質譜聯用儀、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；固相微萃取儀、HP-1510頂空萃取器、100 μm PDMS萃取頭 美國Supelco公司；Rxi-624Sil MS毛細管柱 美國Restek公司；電子天平 德國賽多利斯公司；中藥粉碎機 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；超純水器 成都超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將日本無刺花椒置于烘箱中，40 ℃低溫干燥，篩去椒目，將干燥果皮粉碎后過50目篩，備用。

1.3.2 香味物質分析[9,10]

1.3.2.1 樣品萃取與脫附

稱取日本無刺花椒(0.3 g)，置于萃取瓶中；230 ℃下活化萃取頭(3 min)，將萃取頭插入萃取瓶中，50 ℃下萃取30 min；再將萃取頭插入氣相色譜儀的進樣口，230 ℃下脫附3 min。

1.3.2.2 氣相色譜-質譜條件

采用HP-5(0.25 mm×30 m，0.25 μm)石英毛細管柱。升溫程序：起始柱溫50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min上升至200 ℃，保持5 min；15 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。載氣為高純度氮(N2)，柱前壓53 kPa，分流比36∶1。進樣口和接口溫度均為230 ℃；電子轟擊EI離子源，電子能量70 eV；掃描范圍(m/z)50～550，全掃描模式進行采集。

1.3.2.3 定性分析

香味物質的定性分析由質譜儀所帶數據包(Wiley Library ver. 9、NIST Library ver. 14和 NIST Library ver. 14s)進行自動檢索與匹配。本實驗中，僅統計匹配度大于90的香味物質，確保數據的嚴謹性。香味物質的定量分析則采用峰面積歸一化法。

1.3.3 麻味物質分析[11-13]

1.3.3.1 樣品制備

取日本無刺花椒0.5 g，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率240 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻至室溫，再次稱定重量，以甲醇來補足超聲過程中減失的重量，搖勻，分析前采用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續濾液，即得。

1.3.3.2 液相色譜條件

PHENOMENEX C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈-水(40∶60)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長270 nm，進樣量10 μL。

1.3.3.3 定量分析

以自制的羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素作為對照品，配制成系列不同濃度的混合對照溶液。經麻味物質定量測定方法學考察后，采用高效液相色譜法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 香味物質的定性分析

按上述實驗條件進行實驗，日本無刺花椒香味物質總離子圖見圖1，GC-MS分析結果見表1。

圖1 日本無刺花椒香味物質總離子圖Fig.1 Total ion current chromatogram of aroma components of Japanese pepper

表1 日本無刺花椒香味物質的化學成分Table 1 The chemical composition of aroma components of Japanese pepper

續 表

由圖1和表1可知，通過對日本無刺花椒的揮發性成分進行GC-MS分析，共鑒定了21個化合物，占香味化合物總量的99.55%，可反映日本無刺花椒香味化合物組分的大致情況。主要含有烯烴類化合物13個、酯類化合物6個、醛類化合物1個和醇類化合物1個，分別占香味化合物含量的89.31%，2.83%，5.46%，1.95%。根據紅花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的GC-MS分析結果和文獻報道[14]，紅花椒中主要含有烯類、醇類、酮類、醛類、酯類等揮發性成分，以檸檬烯含量最高，乙酸芳樟酯含量次之；相比于紅花椒，日本無刺花椒則以檸檬烯含量最高，小茴香烯含量次之，說明小茴香烯可以作為日本無刺花椒區別于紅花椒的香味化合物。

2.2 麻味物質的定量分析

2.2.1 色譜行為

在選定的條件下，3個麻味物質的色譜峰均達到基線分離，分離度與柱效均良好，混合對照品和樣品的HPLC圖見圖2。

圖2 混合對照品(A)、樣品(B)的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed standards (A) and sample (B)

2.2.2 線性關系考察

分別稱取羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成含羥基-α-山椒素0.8 mg/mL、羥基-β-山椒素0.032 mg/mL和羥基-γ-山椒素0.028 mg/mL的對照品溶液，備用。精密吸取對照品儲備液配制成系列不同質量濃度的混合標準溶液。分別進樣分析3次，并以峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度(μg/mL)為橫坐標(X)進行回歸，得到不同對照品的標準曲線。結果表明，各麻味物質在各自范圍內呈良好的線性關系，見表2。

表2 回歸方程、線性范圍及相關系數Table 2 Regression equations, liner ranges, and correlation coefficients

2.2.3 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液(10 μL)，按“1.3.3.2”項下色譜條件連續進樣分析6次，測定峰面積，結果各成分峰面積的RSD分別是羥基-α-山椒素1.24%，羥基-β-山椒素1.32%，羥基-γ-山椒素1.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液，按照“1.3.3.2”項下色譜條件，分別于0，4，8，12，18，24 h進樣測定，測得各成分峰面積RSD分別是羥基-α-山椒素1.01%、羥基-β-山椒素1.35%、羥基-γ-山椒素1.89%，表明提取液在24 h內基本穩定。

2.2.5 重復性試驗

精密稱取6份日本無刺花椒(每份0.5 g)，按“1.3.3.1”項下方法制備供試品溶液，按照“1.3.3.2”項下色譜條件進行測定分析，結果各成分質量分數的RSD分別為羥基-α-山椒素0.97%，羥基-β-山椒素1.31%，羥基-γ-山椒素1.16%，表明該方法的重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗

精密稱取6份日本無刺花椒(每份0.25 g)，加入混合對照品適量，按“1.3.3.1”項下方法制備供試品溶液，計算各成分的平均回收率。結果表明，羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ山椒素的平均加樣回收率分別為101.23%，98.52%，97.67%；RSD值分別為1.35%，1.58%，2.05%，表明加樣回收結果良好。

2.2.7 含有量測定

精密稱取3份日本無刺花椒(每份0.5 g)，按照上述方法進行分析測定，并計算各成分含有量。結果表明，日本無刺花椒中主要含有羥基-α-山椒素，其含量分別是羥基-γ-山椒素和羥基-β-山椒素含量的21，28倍，見表3。

表3 含有量測定結果Table 3 The determination results of content mg/g

3 結論

本文對日本無刺花椒的香味物質和麻味物質進行了定性、定量分析，其中，HS-SPME-GC-MS聯用技術可準確分析日本無刺花椒的香味物質，有效分離鑒定出21種化合物，主要為烯烴類、酯類、醛類及醇類化合物，并以檸檬烯含量最高，小茴香烯含量次之，2種成分合計占日本無刺花椒香味物質的66.9%，且小茴香烯也是區別于紅花椒的香味化合物。本文成功建立了日本無刺花椒中麻味物質的HPLC分析方法，由混合對照品與樣品的HPLC圖可知，各成分分離效果較理想，適合于麻味物質的定量分析；含量測定結果表明，日本無刺花椒主要含有羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及羥基-γ-山椒素，又以羥基-α-山椒素的含量最高，其含量分別是羥基-γ-山椒素和羥基-β-山椒素含量的21，28倍。本研究分析了日本無刺花椒的香味物質和麻味物質，可為日本無刺花椒的開發利用、質量標準及品質評價提供借鑒，并為四川花椒產業的發展提供理論依據。