腸愈寧對潰瘍性結腸炎大鼠炎性因子及鈣衛蛋白釋放的影響

王海強 鄭麗紅 朱 峰 劉朝霞 王靜濱 張 楊 梁國英 劉金狄 張月濤

(1 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，哈爾濱，150040； 2 黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，哈爾濱，150001； 3 黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040)

潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis，UC)屬于炎癥性腸病之一，其發病機制尚不明確，臨床癥狀表現為腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便等[1]。目前，臨床上治療UC主要以糖皮質激素和水楊酸制劑為主，代表藥有柳氮磺胺吡啶和美沙拉嗪，但是不良反應大，無法長期服用。現代醫學研究表明，免疫失衡在UC發生過程中起關鍵作用，過度活化的效應細胞產生的抗體、炎性反應介質、細胞因子引起炎性病變導致組織破壞[2]。二硝基氯苯模型是一個典型的胃腸道遲發變態反應模型,其原理為長期存在的外源性抗原或機體自身抗原激活機體的免疫系統,產生細胞免疫反應,直接誘發或加重UC[3]。

本科室經歷了近10多年的臨床和實驗課題研究，在方法中歸納出清熱解毒，健脾燥濕法治療本病，并經過反復摸索研制出經驗方劑腸愈寧顆粒,在臨床實踐中腸愈寧顆粒治療UC取得了良好的療效，而且其安全性良好。本實驗用DNBS誘導SD大鼠UC模型，研究UC大鼠在腸愈寧顆粒干預下CP在結腸黏膜、血清中的表達的變化和差異，同時結合相關炎性介質進一步闡明腸愈寧顆粒對UC進行有效的阻斷和治療，并提供科學的理論依據

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠60只,均為雄性,體重(250±15)g,由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供。實驗動物許可證號:SCXK(黑)-2014-0003。

1.1.2 藥物 2、4-二硝基氯苯(DNCB):由上海安諾方胺化學品公司生產。腸愈寧顆粒(白頭翁,黃連,黃零,赤石脂,焦白術等)組成。由江蘇天陰藥業生產。柳氮磺胺吡啶(SASP)(上海三維制藥有限公司，生產批號：07051)。用前研碎，用生理鹽水配置成混懸液。

1.1.3 試劑與儀器 VICTOR X3酶標儀，美國PerkinElmer公司;BI-496 2000醫學圖像分析系統，成都泰盟科技有限公司;BT 25S型電子分析天平，德國Sartorius公司;HWS24恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司;電泳儀,上海精密儀器儀表有限公司，高速臺式離心機,科大創新股份有限公司，凝膠成像分析系統。OML-QPA型生物組織切片機，湖北歐美萊醫療科技有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用二硝基氯苯乙酸復合法制備大鼠UC模型。將60只SD大鼠隨機分成實驗組50只和正常組10只。實驗組大鼠背部剃毛后,用2% 2,4-二硝基氯苯丙酮溶液滴背部,1次/d,每只鼠5滴/次,連續14 d致敏。15 d向肛內約6 cm處的結腸腔內用1% 2,4-二硝基氯苯乙醇液保留灌腸0.35 mL,于16 d在同部位注入0.1%乙酸溶液2 mL,準確計時15 s后，再用5.0 mL生理鹽水沖洗。造模前后均給予大鼠高脂飲食。17 d隨機抽取2只造模大鼠處死，取其結腸標本，病理檢查確認有充血，水腫及典型潰瘍形成即為造模成功。

1.2.2 給藥方法 各觀察組均于造模后1 d給予相應藥物灌胃，連續兩周。在建立UC病變動物模型的同時，腸愈寧高劑量組、中劑量組、低劑量組(CYN-L，CYN-M，CYN-G)分別灌服相當于生藥量為1 g/mL、2 g/mL、4 g/mL的腸愈寧顆粒溶液10 mL/(kg·d)。柳氮磺胺吡啶對照組(SASP):灌服相當于生藥量為0.2 g/(kg·d)柳氮磺胺吡啶懸濁液10 mL/(kg·d),藥物均溶于質量分數為0.5% CMC溶液，超聲溶解。而空白對照組、模型對照組給予等量生理鹽水灌胃10 mL/(kg·d)，在第31天處死大鼠并取材。

1.2.3 檢測指標與方法 疾病活動指數(Disease Activity Index，DAI)參考文獻[4]的方法，分別觀察大鼠體重、大便性狀及血便變化，具體計分標準見表1。

表1 大鼠DAI評分標準

表2 結腸黏膜損傷程度(CMDI)評分標準

結腸黏膜損傷程度(CMDI)及病理學評價：實驗結束后，腹主動脈取血之后，立即解剖結腸，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，用生理鹽水清洗干凈。參考文獻[5]的標準，對各組結腸黏膜損傷程度進行評分比較。于病變處剪取0.6 mm×2.5 mm組織塊，立即置于10%福爾馬林固定液中固定，24 h后進行石蠟包埋，連續切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察結腸黏膜形態。見表2。

血清IL-1β、TNF-α和CP的活性檢測：從大鼠腹主動脈取不抗凝血3～5 mL,靜置凝固后，4 ℃離心機內，3 500 r/min離心12 min，取上層血清，采用雙抗夾心法ELISA測定大鼠血清中IL-1β、TNF-α和CP的含量，按照試劑盒說明書規范操作。在檢測波長450 nm處讀板,通過標準曲線，利用回歸方程計算含量。

表3 腸愈寧對UC大鼠DAI評分的影響分)

注:與正常組比較**P<0.01,*P<0.05;與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01

Western blot檢測腸組織CP的表達：取病變最明顯2.0 cm×3.0 cm處，加裂解液用玻璃勻漿器將其磨碎，離心，后取上清液，送-80 ℃冰箱冷藏。BCA法測定總蛋白濃度，將提取的蛋白25 μg電泳，恒壓90 V電泳至濃縮膠下部，恒壓125 V電泳至分離膠底部；在恒流50 mA濕轉60 min，封閉2 h后，加入1∶3 000稀釋的鼠抗CP抗體，搖床上振搖2 h，再加入1∶5 000稀釋的抗鼠和抗羊IgG，搖床上振搖1 h，Western blot熒光顯影儀進行掃描，曝光。應用Image J 1.8.0軟件對蛋白條帶進行灰度分析，計算條帶灰度值。

2 結果

2.1 腸愈寧對UC大鼠DAI評分的影響 造模開始后，和正常組比較，造模組大鼠在造模幾日之后出現稀便，覓食不主動，肛周污濁，食量減少，持續稀便，而后部分大鼠體重降低，有血便且肉眼可見，說明結腸出現不同程度的損傷和出血。腸愈寧顆粒低、中劑量組癥狀緩解緩慢，食量較少，扎堆、稀便及血便癥狀緩解不明顯；腸愈寧高劑量組、SASP組隨著給藥時間的延長，癥狀明顯好轉，大部分大鼠稀便癥狀消失，基本恢復正常,食量正常，活躍，糞便呈灰褐色顆粒狀，體重略有回升。不同時間點大鼠的DAI分值。見表3。

2.2 腸愈寧顆粒對UC大鼠結腸長寬及CMDI評分的影響 末次給藥次日(造模后22 d),正常組、模型組與各給藥組在結腸長度上并無顯著性差異。見表4。正常組大鼠肉眼觀察結腸黏膜無明顯水腫、糜爛和潰瘍形成。模型組大鼠腸壁可見明顯的充血、水腫，結腸略微縮短;沿腸系膜縱向剖開可見腸壁黏膜，局部有糜爛、出血，并可找到明顯的潰瘍灶，病變主要累及遠端結腸，CMDI評分升高(P<0.01)。SASP組和腸愈寧顆粒各劑量組大鼠腸黏膜病變較模型對照組明顯好轉，呈潰瘍愈合改變。結腸各指數均明顯降低(P<0.01或P<0.05)。

表4 腸愈寧顆粒對UC大鼠結腸長寬及CMDI評分的影響

注:與正常組比較**P<0.01,*P<0.05;與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01

2.3 腸愈寧顆粒對UC大鼠結腸組織病理學的影響 光學顯微鏡下觀察各組結腸組織病的理切片。見圖1。正常對照組黏膜上皮完整，結構清晰，腺體整齊排列,杯狀細胞豐富，隱窩形態正常，炎細胞無浸潤，黏膜下層及肌層未見異常。模型組大鼠結腸黏膜缺失明顯，固有層內腺體結構紊亂，杯狀細胞減少，并有大量炎性細胞浸潤，包括淋巴細胞、漿細胞、單核細胞；并伴有明顯水腫。SASP組和腸愈寧顆粒各劑量組的損傷程度均較模型組不同程度降低，可見大鼠結腸黏膜病變減輕，潰瘍愈合，腺體排列尚規則，存在少量炎性細胞浸潤且腸愈寧顆粒高劑量組與SASP組效果相當。

2.4 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α及Calprotectin(CP)的比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α以及CP的表達量顯著上升(P<0.05或P<0.01);而各劑量觀察組以及陽性藥組血清IL-1β、TNF-α及CP的表達均有不用程度的降低(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

2.5 腸愈寧對腸組織中CP表達的影響 Western blot檢測結果表明，模型組大鼠腸組織中CP的表達較空白組顯著升高(P<0.05)。見圖3。給藥后，各組CP表達發生改變，腸愈寧組較模型組CP表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。且具有劑量依賴性，陽性藥組的調節作用要稍優于腸愈寧組。

圖1 腸愈寧顆粒對UC大鼠結腸組織病理學的影響HE×200

注:A:正常組;B:模型組;D:CYN-low;E:CYN-medium;F:CYN-high;C:SASP5

圖2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α及Calprotectin(CP)的比較

注:##P<0.01,#P<0.05 vs normal group;**P<0.01,*P<0.05 vs model group

圖3 腸愈寧對腸組織中CP表達的影響

注:##P<0.01,#P<0.05 vs normal;*P<0.05，**P<0.01 vs model

3 討論

目前，對于UC西藥尚缺乏強有效的干預手段，UC的西藥治療如美沙拉嗪、4-氨基水楊酸等雖對病情有所控制，不良反應較大。其次是皮質類固醇，是臨床治療急性暴發型和重度潰結患者的首選藥物，長期應用易產生不良反應且不能防止復發。再次是免疫抑制劑，對常規藥物治療無效的UC有一定療效，但對肝、腎及骨髓有毒性[6]。而中醫藥治療潰結體現了較明顯的優勢，近些年中醫藥治療潰結療效顯著，卻無明顯不良反應，體現出中藥治療潰結的優越性。我們經過近20余年的臨床和實驗研究總結出經驗方腸愈寧顆粒。腸愈寧顆粒組方源自金元醫家劉完素的名方白術黃芪湯(《素問病機氣宜保命集·瀉痢論》)，結合我科名中醫治療UC的臨床經驗配藥而成，在臨床應用取得了良好的效果，有效率達90%以上，而且安全性良好[7]。本研究復制了的UC大鼠模型，并通過宏觀和微觀角度考察了UC大鼠腸道炎性反應，實驗結果顯示，腸愈寧顆粒調節了腸道異常免疫反應，使腸黏膜炎性反應和潰瘍基本消除。佐證了腸愈寧顆粒的有效性。

UC病因和病機尚不明確，但免疫異常被公認為在炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)中發揮著決定性的作用，包括細胞因子、炎性反應遞質以及免疫調節等方面[8]。潰結與結腸癌的發生存在一定的因果關系，所以被WHO列為難治之病[9]。細胞因子可分為抗炎性細胞因子和促炎性細胞因子兩類，正常人群中兩類因子處于平衡狀態，有研究表明，當抗炎性細胞因子異常減少或促炎性細胞因子異常增多可導致二者平衡被打破，進而促使腸道黏膜炎性反應的發生[10]

腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)TNF-α不僅具有抗腫瘤的活性,并且還能介導和調節機體的免疫反應、炎性反應、代謝等。TNF-α通過促進內皮細胞粘附分子上調、趨化中性粒細胞發揮凝血酶原效應的作用，進而參與UC的發生,活動期UC,在血漿和糞便中均能檢測到TNF-α的表達,且水平升高[11]。IL-1β屬內分泌型細胞因子,可由多種細胞產生,如巨噬細胞、單核、內皮細胞和中性粒細胞等。在免疫炎性反應中有重要作用。IL-1β具有較多的生物學活性,可以誘導淋巴因子的產生，活化T細胞、誘導急性期炎性反應免疫、蛋白質合成等。UC活動期IL-1β的表達上調,間接提示它對UC的發病起重要作用。

鈣衛蛋白(Calproteetin,CP)是一種雜合性的鈣結合蛋白，來源于中性粒細胞和活化巨嗜細胞胞質，可作為一種炎性標志物。其具有抗蛋白酶活性和耐熱性，在外界環境中和腸腔可長期保持穩定而不被細菌和酶破壞，其主要生物學功能包括抗微生物活性、調節免疫作用、參與細胞信號傳遞、抗增殖和誘導細胞凋亡、炎性反應中調節蛋白等[12]。國外研究表明鈣衛蛋白的穩定性要好于以前的生物標記物，其濃度在UC活動期顯著增加[13]。UC的研究，是目前免疫疾病防治研究的重點，依然存在著許多未解決的問題。鈣衛蛋白作為調節蛋白在UC的防治中的相關研究極少。

本實驗通過免疫印跡檢測(Western blot)結腸組織CP，同時酶聯免疫法(Euzy Melinked Immunosorbent Assay,ELISA)檢查相關炎性介質TNF-α、IL-1β。結果表明模型組大鼠TNF-α、IL-1β的表達明顯高于空白對照組，說明促炎細胞因子參與了UC的發病。經過腸愈寧顆粒治療兩周后，實驗大鼠血清IL-1β、TNF-α的表達較模型組顯著減少。表明腸愈寧顆粒治療UC的機制可能是通過抑制促炎因子IL-1β、TNF-α的表達,進而調整了促炎因子與抗炎因子的平衡。此外，在血清和腸組織中，腸愈寧顆粒組的CP的含量比較模型組有顯著的降低。本研究從細胞免疫和CP調節角度闡述腸愈寧顆粒影響UC的發病機制。本文可以為進一步研究腸愈寧顆粒治療UC的機制以及UC藥物的開發提供理論依據。