梔子苷干預LPS誘導RAW264.7巨噬細胞炎性反應遞質的研究

紀雯婷 尹湘君 劉姝伶 張海霞 王雪茜 魏 瑋

(1 北京中醫藥大學,北京,100029; 2 中國中醫科學院望京醫院,北京,100102)

梔子是目前公認從古沿用至今的品種,在歷代本草中均有詳細論述。其首載于《神農本草經》,被列為中品,主治“五臟邪氣”“胃中熱氣”[1]。《本草綱目》中詳細論述了梔子的作用,后代醫家更是多有發揮,總的來說,梔子具有能清熱,降火、止血的功效[2-6]。現代藥理學研究證明,梔子苷中含有有機酸類化合物、揮發油類,黃麗類、香豆素類及其他多種化合物及微量元素[7-9],可用于中樞神經系統疾病[10-11]、糖尿病[12-13]、心血管系統疾病、等[14-15]。此外,梔子具有強大的抗炎作用[16-17]。研究證明,梔子能抑制炎性反應分子NO以及炎性反應分子TNF-α等的作用[18]。

梔子苷,屬于環烯醚萜類化合物,是梔子中的主要成分[19]。梔子強大的抗炎作用是由梔子苷單獨發揮,還是梔子中的其他成分主導,其研究結果尚不明確。本實驗比較梔子苷水提液、梔子苷標準品、50%梔子苷敲除液、50%梔子苷回填液對LPS刺激巨噬細胞后分泌NO與細胞因子IL-6及TNF-α的調控,試探究梔子發揮抗炎功效的主要成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 細胞為小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)購買于協和細胞資源中心。

1.1.2 藥物 梔子購于北京同仁堂科技發展股份有限公司,梔子苷標準品(貴州迪大,a0057),梔子苷敲除液自備。

1.1.3 試劑與儀器 CO2培養箱(Thermo Fisher scientific公司),離心機(Eppendorf公司),胎牛血清(GBICO公司,10099141),DMEM培養基(GBICO公司,11995065),PBS(南京凱基公司,KGB5001),青鏈霉素(Hyclone公司,SV30010),脂多糖LPS(Sigma公司,L2630-100MG),TFN-αELISA試劑盒(Proteintech公司,KE10002)和IL-6ELISA試劑盒(Proteintech公司,KE10007),E-Plate板(艾森生物有限公司,00300600890),一氧化氮檢測試劑盒(碧云天公司,S0021)

1.2 方法

1.2.1 干預藥物的制備 梔子水提液:梔子100 g,用超純水煎煮藥物1 h,濃縮藥物濃度至1 g/mL。高速離心2次,5 000 r/min,離心10 min/次,收集上清,用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌并分裝,置-20 ℃凍存備用。50%梔子苷敲除液:梔子苷免疫親和色譜巧除法進行[20],敲除約50%的梔子苷,敲除液放入-20 ℃凍存備用。50%梔子苷回填液用梔子苷水提液會回填50%梔子苷標準品,放入-20 ℃凍存備用。

1.2.2 分組與模型制備 收集培養的巨噬細胞,調整細胞濃度為1×105個/mL,種于24孔培養板中,每孔500 μL。設立空白對照組、LPS模型組、梔子苷水提液組、梔子苷標準品組、50%梔子苷敲除液組、50%梔子苷回填組。除空白對照組外,其余各組均加入LPS建立炎性反應模型,使LPS濃度達1 μg/mL,空白組則加入等量培養基。

1.2.3 給藥方法 梔子苷水提液組,梔子苷標準品組以及50%梔子苷敲除液組分別加入相應藥物,經調整藥物濃度,使梔子苷含量相同而50%梔子苷回填液組加入梔子苷回填液,使回填液組梔子苷含量是上述3組中梔子苷的2倍。空白對照組與模型組LPS模型組加入等量培養基,使各組終體積相同。把細胞培養板放置于37 ℃、含5%CO2、飽和濕度培養箱中培育24 h后,收取各組細胞上清,放入-20 ℃凍存備用。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 梔子水提液、梔子苷標準品及50%梔子苷敲除液對巨噬細胞的毒性作用 按照RTCA儀器說明操作。本實驗采用無標記細胞功能分析技術(Real Time Cellular Analysis,RTCA),能高效率、客觀、完整的獲取細胞的毒性動力學曲線。收集培養的巨噬細胞,調整細胞濃度為1×105個/mL,吹打均勻,加入16孔板,100 μL/孔,10倍稀釋等比例稀釋梔子水提液、梔子苷標準品及50%梔子苷敲除,按順序加入16孔中,每個濃度藥物設3復孔,把細胞培養板放置于RTCA儀之中培育72 h后,結束實驗,記錄干預24 h實驗數據并分析。

1.2.4.2 Griess法檢測各組NO含量 按照說明書法檢測NO的含量。取各組細胞培養上清液50 μL加入96孔板中,每組設6個復孔,依次加入氨基苯磺酸、萘基乙二胺,室溫避光孵育10 min,酶標儀540 nm波長檢測,并計算出各組NO的含量(濃度)。

1.2.4.3 ELISA法檢測細胞培養上清IL-6與TNF-α含量 按照試劑盒說明書推薦方法測定。根據說明書要求配制標準品液、10×標本稀釋液及洗滌液。于96孔酶標板中每孔各加入標準品與待測樣品100 μL,將反應板充分混勻后置37 ℃ 2 h,用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次,向濾紙上印干;每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各100 μL(空白除外),將反應板充分混勻后置37 ℃ 1 h,同前洗板;每孔加酶標抗體工作液100 μL。將反應板置37 ℃ 30 min,同前洗板;每孔加入底物工作液100 μL,置37 ℃暗處反應10 min;每孔加入100 μL終止液混勻;5 min內用酶標儀檢OD值,計算出各組相應IL-6與TNF-α含量。

2 結果

2.1 梔子水提液、梔子苷標準品、50%梔子敲除液對巨噬細胞的毒性研究 實驗可知,梔子水提液與梔子苷表標準品對巨噬細胞毒性很小,細胞培養24 h后,10 mg/mL的梔子水提液與梔子苷標準品對巨噬細胞較空白對照組差異有統計學意義(P<0.05),而濃度為150 μg/mL的50%梔子苷敲除液干預巨噬細胞24 h后即可表現出細胞毒性(P<0.05)。值得注意的是,50%的梔子苷敲除液在干預巨噬細胞的過程中,隨著敲除液濃度的增大,巨噬細胞的細胞指數反而上升,具有一定的促細胞增殖作用,75 μ/mL的敲除液效果最為突出(P<10-4)。后續實驗各組干預藥物的濃度依據50%敲除液毒性濃度進行選擇。

2.2 各組巨噬細胞炎性反應遞質NO表達(Griess法)實驗可知,LPS刺激巨噬細胞后NO釋放增多(P<10-4),而梔子苷水提液、梔子苷標準品、梔子苷敲除液均能降低LPS刺激巨噬細胞后NO的釋放,其中梔子水提液、50%梔子苷敲除液以及50%梔子苷回填液的作用最強,且作用差異有統計學意義(P<10-2)。而梔子苷標準品的作用相對較小(P<0.05)。

表1 實驗各組細胞上清NO水平比較

注:與空白對照組比較*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4;與LPS模型組比較,△P<0.05,△△P<10-2

圖1 梔子水提液對巨噬細胞的毒性研究

圖2 梔子苷標準品對巨噬細胞的毒性研究

圖3 50%梔子苷敲除液對巨噬細胞的毒性研究

注:圖1、圖2、圖3中RTCA法檢測梔子水提液、梔子苷表標準品以及50%梔子苷敲除液對巨噬細胞的毒性研究,與空白對照組(0 mg/mL)比較,*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4,NS:差異無統計學意義

圖4 檢測各組NO的表達統計結果

注:與空白組比較*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4;與LPS組比較△P<0.05,△△P<10-2

圖5 檢測各組IL-6與TNF-α的表達統計結果

注:與空白組比較*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4;與LPS組比較△P<0.05,△△P<10-2

2.3 各組巨噬細胞IL-6與TNF-α炎性反應因子表達(ELISA檢測)實驗可知LPS刺激巨噬細胞后,巨噬細胞分泌TNF-α與IL-6較空白對照組增加(P<10-4),梔子水提液干、梔子苷標準品、50%梔子苷敲除液以及含50%梔子苷的梔子水提液干預后,能降低上述細胞因子的分泌(P<0.05),但各組調控作用差異無統計學意義。

表2 實驗各組細胞上清中IL-6與TNF-α水平

注:與空白對照組比較*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4;與LPS模型組比較,△P<0.05,△△P<10-2

3 討論

經LPS刺激的巨噬細胞是成熟的炎性反應模型[21]。在炎性反應過程中,巨噬細胞作為重要的效應細胞,一方面通過抗原識別及呈遞,激活免疫反應;另一方面分泌大量的炎性反應遞質,導致廣泛的炎性反應級聯反應[22]。NO作為主要的炎性反應遞質,在炎性反應的發生和發展中發揮著重要作用。實驗結果可知,梔子水提液、梔子苷標準品、50%梔子苷敲除液、以及50%梔子苷回填液均對NO的分泌有抑制作用。其中,梔子苷標準品的作用較其他溫和。可見,梔子中并不是單一成分梔子苷對NO的分泌起到抑制作用,梔子苷中的其他成分對NO的抑制作用可能更大。

TNF-α與IL-6均是巨噬細胞在炎性反應中分泌的非常重要的促炎因子和調節免疫因子[23]。LPS刺激巨噬細胞促進IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-1β等細胞因子的分泌[24]。IL-6、TNF-α細胞因子的增多,無疑介導或加重機體炎性反應。當梔子水提液、梔子苷標準品、50%梔子苷敲除液、以及50%梔子苷回填液均對TNF-α與IL-6的分泌有抑制作用,且作用差異無統計學意義。可見梔子苷在梔子抗炎這一功效中發揮了作用,這種抗炎作用可能與梔子苷的含量相關。一定范圍內的梔子苷能較為穩定的發揮抗炎功效。此外,梔子中的其他成分也不能排除其抗炎的效能,其很可能與梔子苷共同調節炎性反應,使炎性反應的其他癥狀得到改善。

綜上所述,梔子具有強大的抗炎作用,這種功效不僅僅體現在其主要成分梔子苷上,梔子中的其他成分也發揮了抗炎的作用。且梔子中不同成分很可能從不同的方面調節炎性反應,成分之間可能具有相互協助或者抑制的作用,從而改善炎性反應。本次實驗僅從炎性反應下游的致炎成分展開,尚需要進一步研究梔子苷與梔子在其他藥效作用上的關聯性,全面了解梔子苷對梔子的藥效貢獻。