醫療機構制劑活血益氣方抗瘤丸基于裸鼠荷瘤模型的工藝篩選

陳 菲 馮英楠 張 鵬 莊 偉 林曉蘭

(首都醫科大學宣武醫院藥劑科，北京，100053)

活血益氣方抗瘤丸(簡稱KLW)是治療神經膠質瘤的醫療機構制劑，臨床應用近40年，年銷售額近300萬元，臨床觀察結果證實了該藥的有效性與安全性[1]，具有較強的市場競爭力與較深遠的社會效益和經濟效益，曾獲北京市科技進步一等獎。但是KLW作為醫療機構制劑，僅限本醫療機構使用，為服務廣大患者，急需向新藥轉化。鑒于KLW工藝簡單并缺乏相關數據支持，故在新藥研發過程中，其合理性亟待進一步探索。我們采用荷瘤裸鼠模型，以抑瘤效果為觀察指標，對制劑工藝進行篩選，旨在確定KLW最優工藝，為新藥研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與動物 人神經膠質瘤細胞U87(由首都醫科大學宣武醫院提供)。裸小鼠BALB/c Nude，雄性，18～22 g，126只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物質量合格證號：11401300024482;11401300023307，屏障環境飼養。

1.1.2 藥物 活血益氣方KLW原工藝，簡稱KLW-1，由首都醫科大學宣武醫院提供；活血益氣方KLW待選工藝，簡稱KLW-2、KLW-3、KLW-4，由一諾信遠醫藥科技有限公司制備；替莫唑胺(TMZ，泰道，美國仙靈葆雅公司授權生產，批號：4DZAA04001)。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清(FBS，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號：20150517)，DMEM培養基(Invitrogen corporation，批號：1177237)，胰蛋白酶(Amresco Company，批號：0458)。CO2培養箱(NAPCO 6500型)，生物安全柜(CLASS TYPE B2型)，臺式離心機(eppendorf centrifuge 5430R)，電子數顯卡尺(SF2000型)，倒置顯微鏡(Leica DM3000)，電子天平(PB602-N，TE2101-L)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型建立 1)分組：按照工藝不同分別設置KLW-1、KLW-2、KLW-3、KLW-4的高中低劑量組。KLW-1：按照醫療機構制劑KLW(首都醫科大學宣武醫院，京藥制字Z20063103)再注冊批件(批件號：再20140137B)制法生產。KLW-2：加水煎煮2次，合并2次煎液，取上清濃縮，干燥。KLW-3：川貝、沉香加水、乙醇分別提取2次，提取液合并，取上清液備用；三七等70%乙醇回流提取2次，提取液合并，取上清液回收乙醇；余藥加水煎煮2次，合并2次煎液，取上清液濃縮，與醇提液和川貝、沉香提取液合并，濃縮，干燥。KLW-4：川貝、沉香加入水及乙醇分別提取2次，提取液合并，取上清液備用；三七等加70%乙醇回流提取2次，提取液合并，取上清液回收乙醇；余藥加水煎煮2次，合并2次煎液，取上清液濃縮，加乙醇至含醇量70%，攪勻，靜置，取上清液，回收乙醇，取醇提取液和川貝、沉香提取液合并，濃縮，干燥。

2)模型建立：U87細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中，置37 ℃、5%CO2的培養箱中，常規培養。取對數生長期的U87細胞，0.25%胰酶消化后，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2遍，離心，用無血清的DMEM培養基重懸細胞。將細胞懸液注射至裸鼠右側腋窩，0.2 mL/只，保證5×106個細胞一次性注射至裸鼠右側腋窩。

1.2.2 給藥方法 待動物體內瘤塊長到300～1000 mm3時將裸鼠按瘤塊大小分組，使每組動物的瘤塊大小平均值接近，同時須考慮動物的體重，盡量使各組動物體重平均值接近。分組后立刻灌胃給予不同濃度受試藥物：待測組分別給予高、中、低劑量KLW1～4，陽性對照組給予替莫唑胺膠囊(TMZ)，模型對照組給予同體積的去離子水(滅菌)。給藥劑量見表1。1次/d，連續給藥15 d后處死裸鼠。

表1 各組給藥劑量設定(n=9)

1.2.3 檢測指標 分別在給藥第0、3、6、9、12、15天測量動物體重、腫瘤的最大直徑L(cm)和最小直徑D(cm)，計算各組腫瘤體積V(cm3)，V=1/2×L2×D。并于給藥15 d后處死，剝離瘤塊稱重。

2 結果

2.1 各組小鼠行為學觀察結果 實驗期間，KLW-1高劑量組于給藥后第9天死亡1只，KLW-1低劑量組第9天死亡2只，KLW-2低劑量組第6天死亡1只，KLW-3高劑量組第9天死亡1只，KLW-3中劑量組第9天死亡1只，KLW-3低劑量組分別于3、6天死亡1只，KLW-4中劑量組第9天死亡1只，KLW-4低劑量組第12死亡1只，陽性對照組第9天死亡1只，模型對照組第3天死亡1只。各處方組和模型對照組存活裸鼠臨床癥狀、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便等均未見明顯異常。

表2 KLW對裸鼠瘤塊體積的影響

注:與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 KLW對裸鼠體重的影響 整個給藥期間，KLW-1～4高中低各劑量組裸鼠體重均增長，差異無統計學意義(P>0.05)。陽性對照組裸鼠體重逐漸降低，與模型對照組比較，陽性對照組裸鼠體重在給藥后明顯低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 KLW對BALB/c雄性裸鼠體重的影響

注:與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 KLW對裸鼠瘤塊體積的影響 KLW-1高劑量組在給藥后第3、6、9、12、16天，KLW-1中劑量組第9、12天，KLW-1低劑量組第3、6、9天，LW-2高劑量組第3天，KLW-2中劑量組第3、6、9天，KLW-2低劑量組第3天，KLW-3高劑量組第3、6、9天，KLW-3中劑量組第3天，KLW-3低劑量組第3、6天，KLW-4高劑量組第3天，KLW-4中劑量組第3天，KLW-4低劑量組第3、9、12天，裸鼠瘤塊體積明顯低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。陽性對照組第12、16天，裸鼠瘤塊體積明顯低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4 KLW對裸鼠瘤塊重量的影響 KLW-1高、中劑量組裸鼠瘤塊重量明顯低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，其他待測組裸鼠瘤塊重量與模型對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。陽性對照組裸鼠瘤塊重量明顯低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 KLW對裸鼠瘤塊重量的影響

注:與模型對照組比較*P<0.05，**P<0.01

3 討論

KLW具有利濕解毒、扶正培本、活血化瘀的功效，用于濕熱蘊毒證，適用于腦膠質瘤，腦垂體瘤的輔助治療。臨床研究[2]顯示，早期前瞻性研究其總有效率為64.7%；回顧性研究[3]表明，該藥可以延長惡性神經膠質瘤的生存時間，具有肯定療效?；A研究表明，KLW具有抑制膠質瘤細胞增殖的作用[4-5]，且該作用與促進膠質瘤細胞凋亡相關；經處方篩選，得到優化的KLW處方。然而，作為醫療機構制劑，制劑工藝確定缺乏依據，無相關篩選數據，影響該藥的新藥研發。因此，本實驗在處方優化基礎上進行制備工藝篩選。

KLW由18味中藥組成，由于藥味較多，難以用使用正交試驗的方法進行優化，故通過專家論證會的方式得出待選方KLW-2、3、4，分別將待選工藝與原工藝KLW-1進行抑瘤效果比較。因為原工藝為部分水提取，余下藥味原粉入藥的濃縮蜜丸。因此，在工藝篩選過程中，待選方保證水提部分工藝和劑型不變，為提高藥物利用率，降低服藥量，針對原粉入藥部分進行提取工藝篩選。KLW-2，模擬傳統中藥水煎劑，即水煎兩次合并使用，濃縮加蜜制丸。KLW-3，參考KLW組成藥味中的有效成分，設計提取工藝。經文獻檢索及2015版《中國藥典》要求，對抗KLW原粉入藥的十三味藥味逐一研究。參考君藥三七、土茯苓及具有明確抗癌作用的白英、半枝蓮等有效成分性質[7-14]，如三七有效成分為七皂苷、人參皂苷[15]、土茯苓落新婦苷及總黃酮[16-17]、白英抗癌成分甾體生物堿類和皂苷類化合物[18-20]、半枝蓮醇提物[21]，并結合現代化工業生產的具體情況，將提取工藝設計為70%乙醇回流提取。為使方中川貝、沉香有效成分最大限度保留，采用水、乙醇分別提取。余藥采取傳統水煎煮方法。以上提取液合并、濃縮、制丸。KLW-4，為減少給藥劑量，提高制藥穩定性，在KLW-3基礎上，對水提部分進行醇沉除雜，余下工藝同KLW-3。

本實驗結果表明，KLW各測試組均能在不同程度上降低裸鼠腫瘤體積及重量，其中KLW-1中、高劑量組有統計學意義。各測試組的裸鼠體重與陰性對照組比較無明顯區別。KLW抑瘤效果不如陽性對照藥替莫唑胺，但與陽性對照組比較對裸鼠體重改變較少，體現了中藥與化療藥物相比安全性高。除KLW-3組死亡較多外，其余各組死亡只數近似。經專家組論證，一致認為KLW原工藝成本低廉、抑瘤效果較好，且前期臨床基礎扎實，適用于進一步研發推廣。