苦苣菜水提物對小鼠的鎮咳、祛痰和抗炎作用觀察

王振苗 董麗榮 賈 評 田 慧

(河北北方學院附屬第二醫院，張家口，075100)

苦苣菜又名苦菜，在我國廣泛分布。苦苣菜屬植物的主要活性成分是倍半萜類和黃酮類，此外還有香豆素類、甘油酸酯苷類、木脂素類等[1]。該屬藥用植物及其提取物具有降血糖、降膽固醇、利尿、降壓、抗凝血、保肝、抗炎、抗菌、抗腫瘤等多方面的藥理作用，同時含有維生素C、維生素B1、B2、胡蘿卜素、煙酸等多種維生素，以及銅、鎂、鐵、鋅等多種微量元素，具有很高的營養和藥用價值，開發前景十分廣闊[2]。特別是近年來，許多實驗研究表明該屬植物具有抗菌、抗炎作用，可明顯抑制動物耳腫、足腫，并能抑制腹腔毛細血管通透性增加。但具體機制研究報道較少，且涉及抗氧化、減少NO生成、抑制凋亡等多個方面，缺乏梳理和闡明，本研究探析苦苣菜水提物對小鼠的鎮咳、祛痰和抗炎作用的觀察，效果滿意，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明種小鼠，體重18～22 g，由內蒙古醫科大學實驗動物中心提供，合格證號(SCXK(滬)2002-0010)飼養條件:小鼠分開飼養，籠內墊干燥、清潔刨花，溫度：18～22 ℃、相對濕度：50～60%、噪聲：60 dB以下、換氣：8～20次/h、照明：10～14 h，飼料需富含蛋白質、維生素等營養成分。

1.1.2 藥物 二甲苯(天津市巴斯夫化工有限公司，國藥準字20060812)，碳酸氫鈉(天津市四通化工廠，批號:20010209)；苯酚紅(天津市凱通化學試劑有限公司，批號：20081006)；地塞米松磷酸鈉注射液(山東魯抗辰欣藥業有限公司，批號：09118307)；氯化銨(天津市巴斯夫化工有限公司，批號：20040824)。

1.1.3 儀器 UV-2550紫外分光光度計(日本島津公司)；臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，電子天平(上海恒華科學儀器有限公司)，分析天平(奧豪斯上海有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 苦苣菜水提物的制備 苦苣菜采自內蒙古醫科大學土默特左旗田間，后經內蒙古醫科大學生物學教研室鑒定。苦苣菜全草，陰干，剪碎，稱取原生藥130 g，加適量水浸泡30 min，按照1∶10固液比加水，煎煮60 min，收集濾液I；濾渣加適量水煎煮45 min，得濾液II。合并I、II，經減壓濃縮，得1.3 g/mL濃縮液(濾液Ⅲ)100 mL，冷卻，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 分組與模型制備 二甲苯致耳腫脹模型：末次給藥30 min后，于小鼠右后跖皮下注射1%角叉菜膠30 μL致炎，5 h后斷頭處死小鼠，取血，并從跟骨水平(踝關節中線以下)對稱剪下鼠足，稱重，以左、右足重量差作為小鼠足腫脹度。根據隨機對照法分為正常空白對照組、模型組、苦苣菜水提物劑量I組、苦苣菜水提物劑量II組、苦苣菜水提物劑量III組，每組均為10只，

1.2.3 給藥方法 參照“常用動物與人體表面積比值表”，通過換算，確定本次實驗采取灌胃給藥途徑，小鼠的苦苣菜水提物各組給藥濃度分別為0.26 g/10 g、0.13 g/10 g、0.065 g/10 g。每次給藥前，倍比稀釋1.3 g/mL濃縮液，得各劑量組溶液。將小鼠隨機分成10組(n=10)，5組進行耳腫實驗，其余5組進行足腫實驗。耳腫實驗中，分別為耳腫模型組、地塞米松2 mg/kg陽性藥物組、苦苣菜水提物0.26 g/10 g劑量組、苦苣菜水提物0.13 g/10 g劑量組、苦苣菜水提物0.065 g/10 g劑量組。各組均采用灌胃給藥，給藥前夜禁食不禁水，給藥容量按體重計算0.2 mL/10 g，連續給藥5 d。苦苣菜水提物各劑量組分別給予不同濃度的苦苣菜水提物，陽性對照組給予地塞米松磷酸鈉注射液2 mg/kg，模型組則分別予以等量生理鹽水。

1.2.4 觀察指標與方法 1)炎性反應相關因子和炎性介質的含量測定：血清：室溫血液自然凝固10～20 min，離心20 min(3 000 r/min)，收集上清，-20 ℃冰箱保存備用。保存過程中如出現沉淀，可再次離心。炎性組織液：整個致炎小鼠足爪稱重后，剪碎，放入3 mL 0.9%的生理鹽水中，充分浸泡。離心20 min(3 000 r/min，-4 ℃)，制得炎性組織液，-20 ℃冰箱保存備用。應用ELISA試劑盒，分別進行環加氧酶2(COX-2)、P38活化蛋白酶絲裂原(p38MAPK)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)含量的測定。

2)鎮咳實驗-氨水引咳法：取小鼠18～22 g，除去3 min內未出現咳嗽反應的小鼠，2 d后取50只合格小鼠，根據體重隨機分為5組，每組小鼠分布予以0.2 mL/10 g灌胃，空白溶液為生理鹽水、模型組、苦苣菜水提液，連續1周；最后一次給藥前禁食不禁水12 h，在最后一次給藥1 h后，將氨水棉球放置在倒置的圓口燒杯下觀察每組小鼠的咳嗽潛伏期和2 min內咳嗽次數(縮胸，腹肌收縮，嘴張大為標準)。

3)祛痰實驗-氣管酚紅法：建立標準曲線：準確稱量0.1 g酚紅，予以5%碳酸氫鈉溶液配制成1000 mL的標準溶液(母液)，在100 mL容器瓶內吸取2.00、1.75、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25 mL母液，應用三蒸水稀釋至刻度；在546 nm處檢測光密度值(OD)分布為0.331、0.295、0.248、0.210、0.169、0.127、0.082，以OD值線性回歸酚紅溶液濃度，得回歸方程；實驗方法：取50只小鼠(18～22 g)，根據體重隨機分為5組，每組分別灌胃苦苣菜水提液、氯化銨溶液、空白溶液(生理鹽水)0.2 mL/10 g，連續1周，最后一次給藥前禁食不禁水12 h，最后一次給藥1 h后，腹腔注射0.1 mL/10 g 0.5%酚紅，酚紅注射1 h后，斷頭處死小鼠，氣管周圍組織進行剝離，將甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管剪下，置于試管內(含有生理鹽水2 mL)，再加入0.1 mL5%碳酸氫鈉溶液，離心半小時，分離上清液，紫外可見光光度計在546 nm處檢測OD值。

4)抗炎實驗：二甲苯致耳腫脹法：取小鼠50只(18～22 g)，根據體重隨機分為五組，每組小鼠分別灌胃苦苣菜水提液、地塞米松溶液、空白溶液(0.2 mL/10 g)，連續1周，最后一次給藥前禁食不禁水12 h，最后一次給藥0.5 h后，在小鼠右耳內外兩側均勻涂抹二甲苯，0.02 mL/只；致炎1.5 h后，斷頭處死小鼠，將小鼠左右耳剪下，在左右耳同一部位應用打孔器打下等大的圓形耳片，稱重，腫脹度為右耳重與左耳重的差值；腫脹抑制率=(對照組腫脹度-給藥組腫脹度)/對照組腫脹度×100%。比較5組對小鼠的鎮咳作用的影響(咳嗽次數、潛伏期)；比較5組對小鼠氣管的酚紅排泌量、苦苣菜水提物抗二甲苯致小鼠耳腫脹影響；比較不同劑量的苦苣菜水提物環加氧酶2(COX-2)、P38活化蛋白酶絲裂原(p38MAPK)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)含量的變化。

2 結果

2.1 對小鼠的鎮咳作用的影響 苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組、模型組與空白對照組比較其潛伏期、咳嗽次數均有降低，但苦苣菜水提物III組的咳嗽潛伏期、咳嗽次數顯與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 對小鼠的鎮咳作用的影響

注:T1/P1為模型組與空白組比較；T2/P2為苦苣菜水提物I組與空白組比較；T3/P3為苦苣菜水提物II組與空白組比較；T4/P4為苦苣菜水提物III組與空白組比較

表2 對小鼠氣管的酚紅排泌量、苦苣菜水提物抗二甲苯致小鼠耳腫脹影響

注:T1/P1為模型組與空白組比較；T2/P2為苦苣菜水提物I組與空白組比較；T3/P3為苦苣菜水提物II組與空白組比較；T4/P4為苦苣菜水提物III組與空白組比較

2.2 5組對小鼠氣管的酚紅排泌量、苦苣菜水提物抗二甲苯致小鼠耳腫脹影響 苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組、模型組與空白對照組比較，其酚紅排泌量均高于空白對照組，但苦苣菜水提物III組的酚紅排泌量與空白對照組比較更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組與空白對照組比較，其抗二甲苯致小鼠耳腫脹均有降低，但苦苣菜水提物III組更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表3 不同劑量的苦苣菜水提物COX-2、p38MARK、TNF-α、IL-6含量的評估比較

注:T1/P1為苦苣菜水提物I組與空白組比較；T2/P2為苦苣菜水提物II組與空白組比較；T3/P3為苦苣菜水提物III組與空白組比較

2.3 不同劑量的苦苣菜水提物環加氧酶2(COX-2)、P38活化蛋白酶絲裂原(p38MARK)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)含量的評估比較 不同劑量的苦苣菜水提物與空白對照組比較COX-2、P38MARK、TNF-α指標均有降低，但苦苣菜水提物III組的臨床指標顯著低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

炎性反應是機體在致炎因子作用下所發生的以防御反應為主的病理反應或病理過程。炎性介質是一種生物活性物質，在細胞或體液中產生[3-6]。這些物質通過各種途徑作用于血管，引起血管擴張、通透性增加和引起滲出，在炎性反應的發生發展過程中起重要作用。研究藥物的抗炎作用，受限必須復制動物模型的炎性反應，一般先選用以血管通透性為主要改變的急性炎性反應模型進行評價。二甲苯致耳腫脹模型是國內比較常用的抗炎機制模型。角叉菜膠致小鼠足腫脹模型是一個急性非感染性炎性反應模型，當給小鼠足跖內注射角叉菜膠時能發生與人體相似的急性炎性反應，如局部毛細血管擴張、血管通透性增高、滲出、水腫等，骨該模型在新藥評價中應用十分廣泛。該模型具有差異性小，高度重現性等特點[7-8]。

本研究探析苦苣菜水提物對小鼠的鎮咳、祛痰和抗炎作用觀察，結果顯示：苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組、模型組與空白對照組比較其潛伏期、咳嗽次數均有降低，但苦苣菜水提物III組的咳嗽潛伏期、咳嗽次數顯與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組、模型組與空白對照組比較，其酚紅排泌量均高于空白對照組，但苦苣菜水提物III組的酚紅排泌量與空白對照組比較更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組與空白對照組比較，其抗二甲苯致小鼠耳腫脹均有降低，但苦苣菜水提物III組更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；不同劑量的苦苣菜水提物與空白對照組比較COX-2、P38MAPK、TNF-α、IL-6指標均有降低，但苦苣菜水提物III組的臨床指標顯著低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)，與康文藝等[9]的研究結果大體一致，苦苣菜提取物具有顯著的抑制作用，且該提取物能夠顯著減少小鼠的染色皮膚面積和皮膚染料量，當小鼠腹腔毛細血管通透性增加時，該提取物也具有一定的抑制作用，隨著提取物含量的變化，小鼠足炎性反應某些衡量參數也具有顯著改變；在抗凝血方面，苦苣菜提取物的效果十分明顯；本研究結果顯示苦苣菜水提物可顯著延長氨水誘導的小鼠咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數，提示該藥具有顯著的鎮咳功能[10-13]；同時可促進小鼠氣管排出酚紅量，增加小鼠氣管痰液分泌量，且可顯著降低COX-2、P38MAPK、TNF-α、IL-6水平，說明苦苣菜提取物具有顯著的抗炎作用。綜上所述，苦苣菜水提物可不同程度的抑制炎性腫脹，其對急性炎性反應的保護作用可能與下調機體的COX-2、P38MAPK、IL-6、TNF-α等細胞因子和炎性反應介質的釋放，以及調節機體有關炎性反應發生通路有關。