繁殖期高體鳑鲏對化學預警信息的行為響應及其與生理狀態的關聯

張 嬙,付世建,夏繼剛

重慶師范大學生命科學學院,進化生理與行為學實驗室,重慶市動物生物學重點實驗室, 重慶 401331

與陸生動物相比,由于受到水體透明度、濁度等生態因子的制約,魚類的視覺通訊受到很大限制,依賴于嗅覺系統的化學通訊成為魚類生存的必要選擇[1]。1942年,Frisch最先發現并報道了歐洲真鱥(Phoxinusphoxinus)化學預警信息(Chemical alarm cues, CAC)的釋放及其功能[2]。后來的研究發現證實：骨鰾總目中的大多數魚類,例如鯉科(Cyprinidae)、鯰科(Siluridae)、脂鯉科(Characidae)、慈鯛科(Cichlidae)和鮭科(Salmonidae)等魚類均可分泌CAC[3]。CAC是由魚類表皮棒狀細胞分泌的一種次黃嘌呤- 3-N-氧化物(Hypoxanthine- 3-N-oxide)或一組功能相似的化合物,當魚體受到來自捕食者等外界的機械性損傷時釋放至水體,可引起同伴迅速的預警/反捕食響應[4- 6],從而提高種群的整體適合度。由于其重要的生態學功能,CAC在魚類行為學、水域生態學、進化以及保護生態學等領域已備受科學家重視,相關研究正逐漸成為熱點。

對CAC的識別與應答體現了魚類在特定生理狀態和特定環境下的生態策略,與動物的生存適合度密切相關[6- 8]。盡管CAC對魚類的生存至關重要,然而由于魚類CAC的產生及其行為應答本身是一種較為耗能的生理過程[9- 10],在不同生活史階段魚類往往面臨基于能量供需的“生存-繁殖”、“生存-發育”等的權衡(Trade-offs)。例如,我們前期研究發現,生活史早期孔雀魚(Poeciliareticulata)仔魚并不表現出對同生群個體CAC的行為應答,但發育14 d后的仔魚卻表現出顯著的行為回避響應[6]。由于繁殖是一種高能耗的生命活動[6, 11],繁殖期魚類的化學預警通訊是否表現出基于能量代價-收益(Cost-benefit)的權衡？

迄今為止,有關非繁殖期魚類對CAC的行為響應及其生態機制已有較多研究報道[9, 12- 13],僅有少量學者探究了繁殖期魚類的化學預警通訊。有趣的是,研究發現某些硬骨魚類繁殖期CAC的產生及其行為應答模式缺失[14- 15](這也是很多學者在魚類化學預警通訊研究中避開繁殖期的主要原因),并且該變化特征顯著受到性別的影響。例如,繁殖期雄性黑頭呆魚(Pimephalespromelas)無產生CAC的細胞而雌魚有[14]；繁殖期不同性別曲口魚(Campostomaanomalum)產生CAC的細胞均大量缺失[15]；繁殖期盲鲃(Caecobarbusgeertsi)雖然保留了其體內用于產生CAC的細胞,但卻對CAC無行為響應[16]；類似地,生殖洄游期間太平洋鮭魚(Oncorhynchusnerka)對同伴遭遇應激刺激后所釋放信號的行為響應也存在性別差異[17]。那么,繁殖期魚類對CAC的行為應答又是否存在性別差異？繁殖投入是否是魚類化學預警通訊弱化的主要原因呢？

為探究以上科學問題,本研究選取具有特殊繁殖方式的高體鳑鲏(Rhodeusocellatus)作為實驗對象。高體鳑鲏隸屬于鯉形目鯉科鳑鲏屬,是一種小型淡水魚類,廣泛分布于池塘、湖泊以及河灣緩流淺水區。該物種與河蚌(Unionidae)是共生關系,繁殖能力較弱,繁殖時通過產卵管(Oviduct)將卵產至河蚌的外套腔內,同時雄魚在河蚌入水孔附近排精,精子隨水流入外套腔完成受精,最終受精卵在河蚌鰓瓣中發育成幼魚后游出[18]。與大多數魚類相比,高體鳑鲏的繁殖投入較低(非卵胎生生殖方式、無生殖洄游、無筑巢行為、無撫幼行為,產卵量和性腺指數較低),據此推測：①繁殖期高體鳑鲏的化學預警通訊不會缺失(推測一),②但繁殖投入較高的個體行為響應較弱(推測二)。高體鳑鲏號稱“中國彩虹”、“水中蝴蝶”,尤其在繁殖期雄性個體由于性選擇的作用體色格外鮮麗,這將可能增加其被捕食風險,但雌魚體色卻無巨大變化,加之雄性相對較少的繁殖投入,③繁殖期高體鳑鲏的化學預警響應存在性別差異,即雄魚較雌魚對CAC的行為響應程度更大(推測三)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

高體鳑鲏于2017年5月捕撈自重慶師范大學進化生理與行為學實驗基地魚塘(該魚塘面積約為0.4669hm2,自然生態系統已維持十年以上),并于實驗室條件下馴養適應2 d。馴養水槽長200 cm、寬100 cm、高50 cm,實際水深30 cm,馴養用水抽取自池塘。馴養期間,水溫(24±1)℃,溶解氧大于6 mg/L,馴養密度低于0.12 g/L,光周期12 L∶12 D；每日早晚(08:00 am和06:00 pm)以商業餌料各飽足投喂1次。馴養結束后,選取健康活潑、大小相近、處于繁殖Ⅳ期的個體開展實驗。

1.2 實驗方案

1.2.1 CAC制備

選取大小相近的性成熟高體鳑鲏(雌魚：體重(0.61±0.049) g、體長(3.14±0.055) cm,n=11；雄魚：體重(0.83±0.074) g、體長(3.32±0.092) cm,n=10)用于預警物質的制備。首先將實驗魚鈍擊后斷頭處死,迅速剝離身體兩側的皮膚組織并精確計算出其面積大小,之后,將所剝離的皮膚組織混合加入一定量的水(魚塘池水)低溫勻漿,充分破碎皮膚細胞,過濾,并最終配制成10 mL/cm2的目標溶液(CAC)[6, 8]。將目標溶液及時分裝至若干10 mL的小袋中于-20℃冷凍保存并于一周內用于實驗研究。

1.2.2 行為學測試

實驗觀測設備為自制的方形水槽(長60 cm、寬10.5 cm、高60 cm)。將單尾實驗魚轉移至實驗水槽(實際水深為30 cm),并給予15 min的適應期(依據預實驗研究結果,15 min后絕大多數實驗魚恢復自發游泳狀態)。適應結束后,用攝像頭(Logitech Webcam Pro 9000,15幀/s)拍攝記錄實驗魚的行為響應,拍攝時間為5 min(Pre-test)；采用注射器將CAC(實驗組)或魚塘池水(Pool water, PW; 對照組)10 mL通過管道緩緩推入實驗水槽(操作時間為30 s并給予30 s的加樣操作恢復期)；之后,接著拍攝記錄5 min(Post-test)。實驗共使用測試水槽4個,其中兩個用于實驗組(被試雌雄實驗魚各一個),兩個用于對照組(被試雌雄實驗魚各一個)；每做完一個重復,將所有實驗水槽沖洗三遍,確保無CAC及被試魚化學信息殘留。用于行為學測試的雌雄實驗魚處理組和對照組均為20尾(n=20)。視頻錄制期間,水溫水質條件與馴養期間保持一致。

采用Noldus動物運動軌跡跟蹤軟件(EthoVision XT 9.0, Noldus, Netherlands)對視頻進行分析。通過對實驗魚空間分布狀態(底棲時間)、活躍狀態(靜止時間、運動距離和身體不重合度,其中靜止狀態的判斷標準為實驗魚的圖心位移小于1 cm/s)、逃逸行為(高速運動時間,即運動速度大于30 cm/s的時間)的解析來量化實驗魚的預警響應。本研究中,空間分布狀態、活躍狀態、逃逸行為分別被看作是實驗魚的I級、II級和III級預警響應。

1.2.3 形態及生理參數測定

視頻錄制結束后,將實驗魚用MS- 222麻醉,檢測其健康狀況并用分析天平和直尺測定體重、性腺重、體長、產卵管長度(Oviduct length,OL)等,并依據以上參數計算出肥滿度(Condition factor,CF)和性腺指數(Gonado somatic index,GSI)(表1)。

CF=(m/L3) × 100,式中L為體長,m為體重；

GSI=m′/m× 100,式中m′為性腺重,m為體重。

1.3 數據分析

應用SPSS軟件(SPSS 19.0 Inc., USA)對數據進行統計分析。首先對實驗數據進行正態性和方差齊性檢驗。若數據滿足正態性和方差齊性,采用雙因素方差分析和Tukey′sHSD多重比較檢驗差異顯著性；若數據不滿足正態性和方差齊性,采用Scheirer-Ray-Hare分析[19]檢驗差異顯著性,采用Mann-Whitney U檢驗分析實驗魚對PW和CAC的響應,采用Sign檢驗分析實驗前后(Pre-test vs. Post-test)動物行為的變化,Spearman相關分析檢測實驗魚行為變化與其生理參數(性腺指數GSI、產卵管長度OL、肥滿度CF)的關聯。數據均以平均值±標準誤表示,顯著性水平設在P<0.05。

表1 高體鳑鲏形態及生理參數

數據以平均值±標準誤表示(n=20)

2 結果

圖1 化學預警信息對不同性別高體鳑鲏空間分布的影響 Fig.1 The effects of chemical alarm cues and gender on the spatial distribution of Rhodeus ocellatus*表示引入信息前后底棲時間的顯著差異(P<0.05); #表示引入不同信息后底棲時間的顯著差異(P<0.05),PW: 池水 Pool water; CAC: 化學預警信息 Chemical alarm cues

2.1 高體鳑鲏空間分布對CAC的響應

CAC對雌性實驗魚的底棲時間影響顯著(P<0.05,表2,圖1)。不同性別鳑鲏底棲時間對CAC的響應無顯著差異(P>0.05,表2,圖1)。

2.2 高體鳑鲏活躍狀態對CAC的響應

CAC對雌雄實驗魚靜止時間和身體不重合度影響顯著(P< 0.05,表2)；CAC僅對雌性實驗魚的運動距離影響顯著(P<0.05)。不同性別實驗魚靜止時間、運動距離和身體不重合度對CAC的響應無顯著差異(P>0.05,表2,圖2)。

2.3 高體鳑鲏逃逸行為對CAC的響應

CAC對實驗魚的高速運動時間無顯著影響(P>0.05,表2,圖3)。不同性別實驗魚高速運動時間對CAC的響應無顯著差異(P>0.05,表2,圖3)。

2.4 高體鳑鲏化學預警響應與繁殖生理狀態的關系

除了高速運動時間的變化與性腺指數(GSI)呈現弱負相關(r=-0.445,P<0.05,表3,圖4),實驗魚其余化學預警行為參數的變化與GSI、產卵管長度(OL)、肥滿度(CF)等均無顯著相關性(P>0.05; 表3; 圖4)。

表2 化學信息和性別對高體鳑鲏行為響應參數的影響

*P<0.05,差異顯著

表3 高體鳑鲏化學預警響應的變化與其繁殖生理狀態的關系

*P<0.05,差異顯著

圖2 化學預警信息對不同性別高體鳑鲏活躍性的影響Fig.2 The effects of chemical alarm cues and gender on the activity of Rhodeus ocellatus*表示引入信息前后活躍狀態的顯著差異(P<0.05)；#表示引入不同信息后活躍狀態的顯著差異(P<0.05)

圖3 化學預警信息對不同性別高體鳑鲏逃逸行為的影響 Fig.3 The effects of chemical alarm cues and gender on the escape behavior of Rhodeus ocellatus*表示引入信息前后逃逸行為的顯著差異(P<0.05)；#表示引入不同信息后逃逸行為的顯著差異(P<0.05)

圖4 高體鳑鲏性腺指數與其化學預警行為的關系Fig.4 The relationships between gonado somatic index and the changes of behavioral responses to chemical alarm cues in Rhodeus ocellatus

3 討論

3.1 繁殖期高體鳑鲏對CAC的行為響應及其性別差異

本研究中,將高體鳑鲏對CAC的應答分為三級行為響應,其重要特點分別是“底棲”、“靜止”、“逃逸”。與已有的大多數研究結果不同[14- 16],本研究證實了繁殖期高體鳑鲏依然展現出一定程度的化學預警通訊,主要體現在底棲時間和靜止時間增加、運動距離和身體不重合度下降(研究結果支持“推測一”)；這表明繁殖期高體鳑鲏對CAC展現出較為溫和的行為應答模式(I級和II級)。另一方面,由于繁殖期魚類的游泳能力降低并且運動所需的能量代價增大,逃逸行為(III級)作為高耗能的行為應答,其對CAC的非顯著變化提示該物種可能存在基于能量代價-收益(Cost-benefit)的權衡。此外,值得注意的是,加樣(加入PW或CAC)前后高體鳑鲏的行為也有一定的變化(圖1—3),提示繁殖期該物種對于物理刺激也有反應。

對多數魚類而言,由于體型、體色、繁殖投入等的差異,不同性別個體的反捕食行為往往差異較大。例如,不同性別紅劍尾魚(Xiphophorushelleri)的預警響應差異顯著,當紅劍尾魚感知到化學預警信息時,雌性的底棲時間以及占用避難所的時間顯著高于雄性[20]。性別二態性使其獲得最大化的生存收益,即：雄性流線型的體型既不易被捕食又不會喪失覓食和尋找配偶的機會；雌性的身型限制了其逃逸能力,避難和底棲行為才能保證其安全[20]。本研究中,高體鳑鲏雖具性別二態性,但對CAC的應答無性別差異(研究結果不符合“推測三”),研究結果提示：盡管由于性選擇的作用繁殖期雄性個體色鮮麗,但是否這種體色的變化增加其被捕食風險有待于進一步研究。

3.2 繁殖期高體鳑鲏對CAC的行為響應與其生理狀態的關聯

GSI和CF作為魚類性腺發育和能量儲備狀況的重要指標,為評估魚類的繁殖投入提供了參考。Pollock 等研究發現,繁殖期黑頭呆魚的CF、GSI均與其反捕食行為無統計學意義上顯著相關性,但GSI與反捕食行為存在負相關趨勢[21]。然而,Bachman 1993發現,CF較低的Belding′s地松鼠(Spermophilusbeldingi)警戒響應更弱[22]。本研究顯示：繁殖期IV高體鳑鲏化學預警行為的變化與其生理狀態(GSI、CF、OL)無顯著相關性(研究結果不符合“推測二”),研究結果與Pollock等類似[21],但原因不盡相同。Pollock等認為,實驗室馴養導致的魚體生理狀況同質化是造成黑頭呆魚化學預警響應與生理狀態不相關的主要因素；本研究對象為高體鳑鲏野生種群,造成上述結果的原因可能有以下幾個方面：

其一,高體鳑鲏與河蚌是共生關系,通過河蚌完成受精以及胚胎和仔魚發育,繁殖投入較低。盡管實驗對象為野生種群,相對而言,魚體生理狀況仍趨近同質化。從這一點考慮,造成高體鳑鲏化學預警行為與生理狀態不相關的原因本質上與Pollock等相近。

其二,由于繁殖投入低,高體鳑鲏對CAC的行為響應可能更多的與其個性行為(Personality)有關[23],而受繁殖狀態的影響小。本研究中,高體鳑鲏的個性行為可能掩蓋了繁殖狀態的效應,進而導致化學預警行為與生理狀態不相關。

其三,從進化生態學的視角來看,魚類的化學預警通訊反應了魚類在特定生理狀態和特定環境下的生態策略。CAC為魚體遭遇捕食者等外界的機械性損傷時釋放至水體,引起同伴預警/反捕食響應,對提高種群生存適合度顯然是有利的；然而,繁殖期魚類的集群性不強,化學預警通訊相對低效,在這種情況下,魚類對CAC的行為響應程度可能更多的與其社群等級地位、被捕食經歷等有關,而受生理狀態的影響較弱。

綜上,CAC在魚類捕食-反捕食功能關系中扮演重要角色,然而,在特定的生境和生理狀態下動物通常面臨基于能量代價-收益的權衡。盡管少量研究發現某些硬骨魚類繁殖期CAC的產生及其行為應答模式缺失,但我們推測這種現象并不是普遍存在的(本研究已經證實繁殖期高體鳑鲏依然展現出一定程度的化學預警通訊)；與Pollock等研究結果類似[21],盡管本研究也未檢測到魚類化學預警行為的變化與繁殖生理狀態的相關性,但我們推測這種相關性的有無/強弱在不同魚類中可能差異較大,在未來研究中著眼于繁殖期不同繁殖投入/繁殖對策魚類的化學預警通訊的比較生理學與進化生態學研究是十分必要的。