第3天冷凍胚胎提前解凍培養至第5天移植的臨床效果

習海濤，陳華，張帆，劉曉明，付養華，趙軍招

（溫州醫科大學附屬第二醫院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

體外受精聯合凍胚移植技術（in vitro fertilization frozen embryo transfer，IVF-FET）受精率約為70%，大約只有一半的正常受精的胚胎發育到第3天，而只有33%的胚胎能夠發育至囊胚[1-2]。異常的胚胎的基因激活后發育阻滯，而形成的囊胚則具有較好的胚胎著床能力[3]。人們進行第3天胚胎移植時，并不知道什么樣的胚胎能發育成囊胚，甚至會將基因異常的胚胎進行移植[4]。

冷凍移植具備提高累積妊娠率、減少促排卵次數、降低卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）發生率、降低異位妊娠風險等優點[5]。但由于試管嬰兒起步階段流行凍存第3天卵裂期胚胎或因囊胚培養的技術的不成熟，許多中心并未將所有的胚胎培養至囊胚進行移植或冷凍，而是凍存了很多的卵裂期的胚胎。本研究對于卵裂期冷凍胚胎較多患者，將對照組卵裂期第3天胚胎解凍與實驗組提前解凍培養至第5天后的胚胎植入率與臨床妊娠率進行比較，以探討第3天卵裂期的解凍胚胎的發育潛能。

1 對象和方法

1.1 對象 將2012年3月至2016年3月在溫州醫科大學附屬第二醫院生殖中心進行冷凍移植周期（frozen transplant cycle，FET），對于卵裂期冷凍胚胎較多的患者（2管以上），將解凍胚胎均為完胚列入本研究中，其中FET周期122個，解凍胚胎185枚。本研究通過本院倫理委員論證，所有患者均簽署相應的知情同意書。

1.2 研究分組 將解凍均為存活的第3天胚胎的FET隨機分為以下2組：A組為當天解凍第3天胚胎培養2 h后移植，共計64個周期，解凍存活90個胚胎；B組為第3天胚胎解凍培養至第5天（培養約48 h）后移植，共計58個周期，解凍存活95個胚胎。記錄B組第3天冷凍胚胎提前解凍培養至第5天的胚胎發育情況，將解凍胚胎培養后移植前有胚胎發育成囊胚或早期囊胚的作為BI組；將細胞數增加，均無胚胎發育成囊胚的周期作為BII；培養后所移植胚胎細胞均未增加的作為BIII組，觀察并記錄臨床效果。

1.3 方法

1.3.1 內膜準備：為減少內膜不同準備方案所帶來的差異，列入本研究的所有周期均為激素替代周期。激素替代周期用于閉經、月經不規律、無排卵且對克羅米芬及小劑量人絕經期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）無反應的患者，于月經周期第2～第3天口服補佳樂2～9 mg（德國拜耳醫藥公司），根據內膜生長情況調整劑量及用藥天數。

1.3.2 胚胎移植時間：激素替代周期主要依據陰道B超下子宮內膜厚度，當≥8 mm時肌注黃體酮使內膜轉化為分泌期，根據實驗分組于內膜準備（黃體酮注射的72 h或120 h左右）即第3天或第5天進行胚胎移植，同時還要參考血中的雌激素和孕激素水平。

1.3.3 黃體支持：激素替代周期組用雌激素（補佳樂）+黃體酮支持，移植后依據患者情況連續或間斷給人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）支持。

1.3.4 胚胎凍融方法：根據胚胎形態學評分方法，將評價為優質胚胎予以玻璃化冷凍，解凍采用快速復蘇法[6]。

1.3.5 妊娠結局的判定[7]：于移植后第14天測尿妊娠試驗及血β-HCG以確定有無妊娠；如β-HCG＞25 mIU/mL為生化妊娠；如患者于移植后28 d陰道B超見宮內有孕囊，確定為臨床妊娠。平均移植胚胎個數=所有周期移植胚胎總個數/總周期數；胚胎種植率=胚胎種植個數/所有周期移植胚胎總個數；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/總周期數；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數

1.3.6 移植后隨訪：懷孕前3個月于本中心隨診，之后采用電話隨訪。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。計量資料用±s表示，2組間的比較用成組t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD方法；多組間率的比較用Fisher確切概率法分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.12組患者一般情況比較 2組患者臨床因素、年齡、HCG日內膜厚度差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.22組臨床效果比較 2組提前解凍培養至第5天胚胎種植率、臨床妊娠率和流產率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 多組臨床效果比較 BI組、BII組、BIII分別與A組比較，提前解凍培養至第5天胚胎發育至不同階段，BI組在臨床妊娠率上高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）；與A組比，BI組在胚胎種植率差異無統計學意義（P＞0.05）；與A組比，BIII組在胚胎種植率、胚胎臨床妊娠率差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表12組患者一般情況的比較

表2 提前解凍培養至第5天胚胎移植的臨床效果比較

表3 提前解凍培養至第5天胚胎發育至不同階段臨床效果比較

3 討論

輔助生殖技術雖然快速發展，但目前活產率仍不甚理想。胚胎移植是影響人輔助生殖技術成功的關鍵因素之一[8]。商業化的序貫培養液的應用提高了胚胎由卵裂期發育到囊胚的概率，由于囊胚較高的植入率，很多生殖中心由此改變原有的移植策略，將移植卵裂期的胚胎改為囊胚，在不影響成功率的條件下單胚胎移植得以開展，用以降低多胎妊娠的風險[9]。

有學者認為[8]在胚胎培養過程中第3天的卵裂期胚胎發育至第5天的囊胚，體內環境更適合胚胎發育的需要，但本研究結果顯示提前2天解凍的胚胎在體外培養并沒有顯示出比卵裂胚胎解凍后直接移植進入體內環境的臨床結果差，兩者比較差異并沒有顯示出統計學意義；因此，卵裂期胚胎生長環境更適于體內或者體外，在本研究中并沒有顯示出明顯差別，經過近10年的努力，序貫培養液的應用顯著提高了胚胎的體外培養技術，使體外培養的環境與體內的差異日漸縮小，使之更接近于體內環境。

體外培養胚胎發育也遵從自然選擇的法則，能發育至囊胚并進行移植，就意味著高的妊娠率，移植前基因診斷的開展也證實了這一假設。第3天優質胚胎有59%為非整倍體，而在好的囊胚中這個比例僅占1/3，明顯可以看出，好的囊胚的異常率明顯低于第3天卵裂期的胚胎[10]。本研究顯示，提前2天解凍的卵裂期的胚胎能夠進一步發育（細胞個數增加或發育至早期囊胚）所占周期數的比例約為91.38%（53/58），而解凍后胚胎存活但并沒有進一步發育的周期數比例則高達8.62%（5/58），也間接證明了目前的胚胎形態學評分體系并不能完美地將非整倍體的異常胚胎挑選出來，本研究也證實了上述觀點。

本研究可以找到改變移植策略帶來較高妊娠率的根本原因。本研究中第3天胚胎提前解凍培養至第5天，在BI組（發育至囊胚）臨床妊娠率高于A組（66.67%vs. 37.5%），差異有統計學意義；盡管在胚胎種植率上并沒有統計學差異，但在數值比較上BI組比A組（46.15%vs. 31.11%）高出很多。這和很多研究的結果相一致[1，11-12]；同時這些卵裂期胚胎解凍后的進一步發育顯示了經過冷凍解凍，仍具有良好的發育潛能和臨床應用前景；解凍后培養發育至囊胚也預示著這個冷凍周期將有好的結局。

但在B組58個周期中，BIII組有5個周期，顯示胚胎解凍后存活但并沒有進一步發育的周期數比例則高達8.62%（5/58），胚胎發育阻滯，這有可能是導致卵裂期冷凍胚胎移植臨床妊娠率一直在較低水平徘徊的重要原因；無論是從BIII組的胚胎種植率和臨床妊娠率上都證明了這一點。當然從另一個側面來看，卵裂期冷凍胚胎提前解凍，對于那些胚胎存活但并沒有進一步發育的周期來說，是否取消周期或再行解凍以及預測臨床結果，可以提供一個很好的參考。

本研究提示將第3天胚胎提前解凍，體外培養至第5天并不影響臨床效果，而且可以提前評估冷凍移植周期的臨床效果。