鹽脅迫對寧夏水稻不同品種萌發指標和同工酶的影響

趙會君， 馬名立， 代飛燕， 任慧聰

(北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021)

土壤鹽漬化是土地資源面臨的重大問題，據統計，我國現存的不同鹽堿地類型面積大約為9 913萬hm2，主要分布于柴達木盆地、銀川平原、濱海地區、河西走廊、新疆等地區，約占全世界土地面積的25%[1]。寧夏回族自治區處于溫帶半干旱、干旱區，位于西北地區東部、黃河中上游，空氣干旱，降水稀少(平均年降水量為292 mm)，致使蒸發強烈(水面蒸發量為 1 296 mm)，近年來由于黃河水的引灌而造成引黃灌區的土壤鹽漬化問題逐年加重，引起了寧夏回族自治區政府及有關人員的高度關注[2]，寧夏土壤的鹽堿化對于寧夏的糧食生產和某些作物的種植影響巨大，銀川北部地區鹽堿地已占總耕地面積的49%以上。水稻是寧夏平原地區的主栽糧食作物，也是引黃灌區的重點種植作物，因此篩選抗鹽性較強的水稻品種是利用鹽堿地的重要措施之一[2-3]。

植物一生中對逆境忍耐力最大的部位是種子，幼苗最小[4-5]。種子萌發是植物生長發育的一個關鍵時期，水稻種子中含有大量的淀粉顆粒，種子萌發時α-淀粉酶就具有活性，并在糊粉層中快速形成而將淀粉水解，α-淀粉酶與赤霉素的調控有關，隨著時間的延長其活性不斷增大[6]。α-淀粉酶的活性越高，種子中的淀粉轉化成營養物質的能力越強，而鹽脅迫對α-淀粉酶的影響是研究鹽堿脅迫的重要生理參數。水稻萌發期是水稻生長的起始點，對植物的后期生長發育起著至關重要的作用。因此通過對逆境脅迫下種子萌發和生長的研究，可以篩選一些抗逆性的品種[7]。當形態建成后，幼苗進一步受到抗氧化系統的保護，在一般鹽脅迫情況下，植物體內的過氧化物酶(POD)等的活性和植物的抗氧化脅迫能力呈正相關，另外，某些植物體內的過氧化物質如抗壞血酸也有清除體內自由基的生理功能[8]。因此，本研究以寧夏主栽水稻品種節七、寧粳41、寧粳28及日本晴為材料，研究鹽脅迫對不同水稻品種萌發期形態、生理生化指標的影響，為后期鹽堿地種質資源篩選和寧夏水稻種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 種子萌發及形態指標測量

試驗于2017年1—5月在北方民族大學分子生物學實驗室進行，所選擇的水稻品種主要有寧夏主栽水稻品種寧粳28、寧粳41、節七及對照品種日本晴。選取大小均一、籽粒飽滿的種子備用。種子用10%次氯酸鈉消毒10 min，并用蒸餾水反復沖洗3～5次，將其依次擺放在鋪有2層濾紙的培養皿中，每個培養皿內放30粒。每個品種設置4個鹽濃度梯度，分別為0(CK)、50、100、150 mmol/L，每個梯度設置3個重復，放置于30 ℃恒溫生化培養箱內進行催芽。發芽期間每天定時記錄萌發數(以種子露白為發芽標準)，萌發第2天開始測量胚芽鞘長度(mm)、主根長度(mm)、胚根數，每次隨機挑選10粒進行測量，并計算各形態指標的平均值，統計萌發率。萌發率=發芽粒數/供試粒數×100%。所得數據采用GraphPad Prism 5.0統計軟件進行分析。

1.2 酶液的提取及同工酶電泳和α-淀粉酶活性的測定

取處理不同時間的0.5 g新鮮組織，加入5 mL冰預冷的 50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH值為7.0)于冰浴中研磨，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，收集上清液即為酶粗提液，可溶性總蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。同工酶電泳采用北京六一儀器廠生產的垂直板凝膠電泳儀，電泳時α-同工酶、超氧化物歧化酶(SOD)、POD以及過氧化氫酶(CAT)采用10%分離膠和5%濃縮膠，總上樣量為 35 μL，預電泳10 min，濃縮膠中穩定電壓為80 V，進入分離膠后穩定電壓為120 V，電流為200 mA。于冰浴中電泳3～4 h后當指示染料下行至距膠板末端1～2 cm時停止電泳。

α-淀粉酶同工酶染色采用淀粉法[7]，SOD同工酶染色采用氮藍四唑法[9]，POD同工酶染色采用醋酸-聯苯胺法[10]，CAT染色采用淀粉法[11]。根據染色的酶譜計算相對遷移率Rf(Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離)。

2 結果與分析

2.1 不同處理濃度和時間下4個水稻品種的萌發趨勢

如圖1所示，4個水稻品種在不同鹽脅迫下的萌發率隨著鹽濃度的增大而不斷降低，說明鹽脅迫抑制了種子的萌發，但是節七在5 d內的萌發趨勢基本一致(圖1-a)，在最高濃度的鹽脅迫下第2天萌發率就已達到78%，寧粳28的萌發率在第2天達到50%左右，寧粳41的萌發率在第4天達到30%左右，而日本晴在第4天才開始發芽。這顯示節七在高濃度的鹽脅迫下保持了較高的萌發率，可能對鹽脅迫有較高的抗性。

2.2 不同水稻品種在鹽脅迫下萌發形態的差異

如表1所示，與對照相比，所有品種經過鹽脅迫后，胚芽鞘長和胚根數、胚根長都受到極顯著抑制(P<0.001)，而寧粳41和寧粳28以及節七品種相比日本晴，抑制程度較輕，這表現在胚芽鞘長和胚根長受抑制程度上，這些形態指標是早期鑒定傷害的重要指標。

表1 萌發第3天的形態指標

注：所有數據來源于3次重復±標準誤，大寫字母A表示與CK相比在0.001水平差異顯著。

2.3 不同鹽濃度處理對節七α-淀粉酶同工酶的影響

以鹽脅迫下萌發率較高的品種節七為研究材料，α-淀粉酶-同工酶圖譜如圖2所示。由圖2可以看出，在非脅迫情況下，在萌發第1天，種子中出現了1條遷移率為0.34的條帶，在萌發第2天，出現了2條遷移率分別為0.34、0.43的條帶，顯示種子中的淀粉酶隨著萌發時間的延長出現條帶增多和強度增加的趨勢。在鹽脅迫條件下，萌發第1天，α-淀粉酶-同工酶出現被抑制的現象，表現在隨著鹽脅迫時間延長及濃度的增加，酶帶亮度減小，寬度減少，說明鹽脅迫導致α-淀粉酶同工酶活性下降，而在處理第2天，與對照相比同工酶仍然呈被抑制趨勢。

2.4 不同濃度處理下節七抗氧化同工酶的變化情況

由圖3可知，與對照相比，鹽脅迫后SOD亮度和條帶數增加，說明SOD同工酶受鹽脅迫的誘導；CAT同工酶第3個亞基酶帶寬度增加，POD同工酶表現在隨著處理濃度的增加酶帶減少和亮度降低，這顯示POD也受到了抑制。以上結果說明，鹽脅迫早期就已經對抗氧化酶系統進行了修飾，而CAT和SOD可能主要參與了鹽脅迫早期的活性氧物質的清除。

3 結論與討論

土壤理化環境是影響種子萌發及幼苗生長的重要生態因子，種子的抗逆能力在一定程度上反映了該物種的抗逆程度，植物種子耐鹽性是耐鹽堿植物篩選與早期鑒定的主要依據之一，種子能否在鹽脅迫下萌發成苗，幼苗能否順利度過成熟期，是植物在鹽堿條件下生長發育的前提，因此，研究鹽脅迫下種子萌發生理和幼苗生長具有重要意義[12-14]。篩選抗逆性品種是農業生產中的關鍵因素，這關系到幼苗的形態建成以及后期的產量形成。

種子發芽速率取決于種子吸水速率，種子從外界吸足水分后，貯存在干燥種子中的酶原被激活，種子萌發所需的酶被合成，種子的萌發與α-淀粉酶基因的表達有重要的關系，而鹽脅迫抑制種子萌發的重要限制因素就是低水勢脅迫[14]，本研究發現鹽脅迫對水稻種子中α-淀粉酶同工酶產生了抑制，這是種子萌發率降低的重要原因之一，這一結果也與趙會君等在小麥中的研究結果[7]相似。鹽脅迫對水稻萌發期形態指標的傷害主要表現在胚芽鞘、胚根生長被抑制和胚根數減少，這與藺吉祥等的研究結果[13]相似，可能是過量的Na+在根系的累積導致的毒害癥狀，高濃度的鹽堿脅迫還會抑制植物根系有絲分裂指數而抑制根系生長[15]。而節七品種在較高濃度的鹽堿脅迫下保持著較高的萌發勢，可能對鹽堿具有較強的耐受性，可以作為重要的抗鹽品種在鹽堿地推廣種植。