甲基營養型芽孢桿菌GSBM05產抗菌活性物質發酵條件優化

尹向田， 楊 陽

(山東省葡萄研究院，山東濟南 250100)

2010年Madhaiyan等自水稻根系土壤中分離得到甲基營養型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)，首次明確為新種，并研究發現該菌具有促進植物生長的作用[1]。呂倩等從深海特殊生境下分離篩選到具有較強抗病原真菌活性的甲基營養型芽孢桿菌，并分離純化得到3個主要抗真菌脂肽活性物質，具有較強的抑制黃瓜炭疽病菌、立枯絲核菌、黃瓜枯萎病等植物病原真菌的活性，具有防治作物真菌病害的研發價值[2]。

芽孢桿菌通過分泌一些次生代謝產物來抑制病原菌的生長是芽孢桿菌作用于病原菌的重要機制[3]。自1952年Babard等從枯草芽孢桿菌培養液中分離出抗真菌肽以來，不斷有新的拮抗物質被發現[4]。正是由于具有強大合成抗生物質的能力，離體條件下芽孢桿菌能對多種不同類型的植物病原菌表現出很強的拮抗效果[5]。

甲基營養型芽孢桿菌GSBM05是由筆者所在實驗室在葡萄園根際土壤中分離得到的菌株，初步試驗表明，該菌株對葡萄炭疽病病菌、葡萄潰瘍病病菌、葡萄白腐病病菌等多種葡萄種植中常見的病害均具有良好的生防活性。關于甲基營養型芽孢桿菌發酵條件優化的報道中，有產氨肽酶、產果聚糖蔗糖酶、產3-羥基丁酮等的發酵條件優化[6-8]，但對于甲基營養型芽孢桿菌產抗菌物質發酵條件優化的研究極少，因此，有必要對菌株GSBM05的發酵特性進行深入研究。本研究以葡萄白腐病病菌為靶標，主要以提高抗菌活性物質產量為目的，優化該菌株的最佳發酵條件，以期為該菌株抗菌物質的進一步分離及生防菌劑的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 甲基營養型芽孢桿菌GSBM05菌株、葡萄白腐病病菌，均由山東省葡萄研究院良種與栽培研究所保存。

1.1.2 供試培養基 NA培養基：3 g牛肉浸膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，15 g瓊脂，調節pH值至7.0，定容至1 000 mL。121 ℃ 滅菌20 min，用于GSBM05菌株斜面培養與活化；NB培養基：在NA培養基的基礎上去掉瓊脂，用于GSBM05菌株種子液培養；PDA培養基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 000 mL水，pH值自然，用于真菌的培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備 菌株GSBM05于NA培養基上活化后接于裝有100 mL NB培養液的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養24 h。

1.2.2 測定內容及方法 菌體生物量測定方法：將菌株GSBM05發酵液原液用0.85%生理鹽水稀釋5倍，用721型分光光度計在600 nm波長下測定其D600 nm。

抑菌活性檢測方法：將菌株GSBM05發酵液在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心15 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾得無菌發酵液。刮取在PDA培養基上培養7 d的葡萄白腐病病菌孢子，配成濃度為107個孢子/mL的懸浮液，將孢子懸浮液與PDA培養基以1 ∶50的體積比混勻后倒平板，凝固后在培養皿中間用直徑為7 mm的打孔器(已滅菌)打孔，加入60 μL菌株GSBM05發酵液，3 d后測量抑菌圈直徑。

1.2.3 發酵培養基成分優化 碳源的篩選：在NB培養基中分別添加1%乳糖、甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉、檸檬酸、麥芽糖、蔗糖、麥芽浸膏、甘油、玉米粉、燕麥粉等作為NB培養基中的碳源，其他成分不變。以5%的接種量將種子液分別接種到裝有100 mL液體發酵培養基的250 mL三角瓶中，在 28 ℃、180 r/min條件下培養48 h，測定其D600 nm和抑菌活性，每個處理3次重復。

氮源的篩選：分別以1%蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、酵母膏、(NH4)2SO4、NH4Cl、胰蛋白胨、豆粕、大豆粉等代替NB培養基中的氮源，其他操作同碳源的篩選，每個處理3次重復。

無機鹽的篩選：分別以0.5% NaCl、CuSO4、CaCl2、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、CaNO3、K2HPO4、CaCO3等代替NB培養基中的無機鹽，其他操作同碳源的篩選，每個處理3次重復。

多因素正交試驗：以單因子試驗篩選出的最佳碳源、氮源、無機鹽為變異因素，采用L16(45)正交表進行培養基優化試驗，確定培養基各組分的最佳配比。

1.2.4 菌株發酵條件的優化 以優化后的培養基為發酵培養基，對GSBM05菌株裝液量、接種量、初始pH值、發酵時間、溫度、轉速等發酵條件進行優化。裝液量分別為30、60、90、120、150 mL/250 mL三角瓶；接種量分別為裝液量的2%、4%、6%、8%、10%、12%；初始pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；發酵時間分別為24、36、48、60、72、84、96、120 h；溫度分別為20、24、28、30、32、36、40 ℃；轉速分別為90、120、150、180、220 r/min。每個處理3次重復。

1.2.5 優化培養條件與原始條件防效對比 用篩選出來的發酵優化培養基成分和培養條件對GSBM05菌株進行發酵培養，以原始發酵條件為對照，對比所產抗菌活性物質對葡萄白腐病病菌的抑菌圈大小。

1.3 菌株GSBM05發酵液抑菌活性穩定性的測定

溫度穩定性：將無菌發酵液分別置于40、60、80、100、120 ℃ 溫度下處理30 min，測定其對葡萄白腐病病菌的抑菌活性。

pH值穩定性：室溫下用0.1 mol/L HCl溶液或0.1 mol/L NaOH溶液將菌株GSBM05發酵液的pH值分別調至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，靜置 4 h，再依次將各pH值調回7.0，測定其對葡萄白腐病病菌的抑菌活性。

紫外穩定性：將無菌發酵液分別在紫外燈下照射0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 h后，測定其對葡萄白腐病病菌的抑菌活性。

1.4 數據統計與分析

試驗數據用DPS軟件進行差異顯著性分析，用Microsoft Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基成分優化

2.1.1 不同碳源對菌株生長和抑菌活性物質產生的影響 由圖1可知，不同碳源對菌株GSBM05代謝抑菌活性物質有顯著影響，以檸檬酸為碳源的發酵液抑菌圈直徑及D600 nm均為最小值，而以可溶性淀粉為碳源的發酵液抑菌圈直徑為最大值，為15.5 mm，且此時的D600 nm也較大。因此，選用淀粉為培養基碳源。

2.1.2 不同氮源對菌株生長和抑菌活性物質產生的影響 由圖2可知，以淀粉為固定碳源，不同氮源的發酵液均具有抑菌活性，以(NH4)2SO4、NH4Cl為氮源時，菌株基本未生長，發酵液抑菌效果也不強；以酵母粉為氮源時，發酵液的抑菌活性最高，此時的抑菌圈直徑為17.6 mm，但活菌量并不大；以豆粕為氮源時，發酵液活菌量最高，發酵液抑菌活性也較強，此時的抑菌圈直徑為16.8 mm。因此，選用能提高抑菌活性物質的酵母粉和提高菌株數量的豆粕共同作為培養基的氮源。

2.1.3 不同無機鹽對菌株生長和抑菌活性物質產生的影響 由圖3可知，不同無機鹽對菌株GSBM05發酵液活菌量和抑菌活性影響不同。以NaCl為無機鹽時，菌株GSBM05的抑菌活性最強，但活菌量沒達到最高，CaCO3能有效促進菌株的生長，且抑菌活性也較強。CuSO4、ZnSO4、FeSO4等作為無機鹽時，發酵液活菌量和抑菌活性均較低。因此，選用NaCl、CaCO3作為培養基的無機鹽。

2.1.4 正交試驗優化培養基配比 通過上述碳源和氮源單因子試驗的研究，確定了液體發酵培養基最佳的碳源、氮源、無機鹽等種類。為進一步優化培養基配方，采用L16(45)正交表設計5因素4水平正交試驗(表1)，以發酵液的抑菌圈直徑為判斷標準，確定培養基中各組分的最佳配比。由表2可知，不同培養基配方組合對菌株GSBM05發酵液的抑菌活性有明顯影響。其中，處理10的培養基抑菌活性最強，抑菌圈直徑為22.9 mm。處理1的培養基抑菌活性最弱，抑菌圈直徑僅為13.5 mm。由極差的大小可以看出，培養基配方中的5種組分對發酵液的抑菌活性影響力表現為A>C>B>D>E，由各列相應位級的抑菌圈直徑平均值可以得出最佳水平組合為A3B3C4D2E3。因此，菌株GSBM05產抗菌物質的最佳培養基配方為2.0%可溶性淀粉，2.0%豆粕，3.0%酵母粉，0.3%NaCl，0.3%CaCO3。

表1 L16(45)正交優化培養基配比試驗設計

表2 L16(45)正交優化培養基配比試驗結果

2.2 菌株GSBM05培養條件的優化

2.2.1 裝液量對菌株生長和抑菌活性物質產生的影響 由圖4可知，當250 mL三角瓶中裝液量為90 mL時活菌量和抑菌活性均最高，裝液量過少或過多時，都不利于菌株發酵，說明菌株GSBM05生長對通氣量有一定的要求。因此，最佳裝液量為90 mL/250 mL三角瓶。

2.2.2 接種量對菌株生長和抑菌活性物質產生的影響 由圖5可知，當接種量為2%～12%時菌株均能較好地生長，發酵液均有一定的抑菌活性，在接種量為6%時活菌量達到最大值，抑菌活性也較強。隨著接種量的增加，抑菌活性逐漸降低。這可能是由于接種量過大，導致菌株生長過快，造成溶氧量不足而影響抑菌物質的生成。因此，最適接種量為6%。

2.2.3 初始pH值對菌株生長和抑菌活性物質產生的影響 由圖6可知，菌株GSBM05在pH值為6.0～9.0時均可生長，其中在pH值為6.5～7.5時菌體生長量較高，在pH值為8.0～9.0時菌株生長受到一定抑制，說明堿性條件下不利于菌株GSBM05生長。在發酵液抑菌活性方面，初始pH值為6.0～8.0時發酵液的抑菌活性明顯高于pH值為8.0～9.0時的抑菌活性。在pH值為7.0時，活菌量和發酵液的抑菌活性均達到最大值。因此，發酵液培養基的初始pH值以7.0為最適。

2.2.4 發酵時間對菌株生長和抑菌活性物質產生的影響 由圖7可知，培養24～48 h時，活菌量逐漸增加，在48 h時達到穩定。60～120 h時隨著培養時間的增加，活菌量明顯下降。在發酵液抑菌活性方面，在培養24～72 h時，發酵液抑菌活性逐漸增加，并在72 h時達到最大值。在84～120 h時，發酵液抑菌活性基本保持穩定，僅有輕微的降低。綜合以上結果，確定72 h為最佳發酵時間。

2.2.5 發酵溫度對菌株生長和抑菌活性物質產生的影響 由圖8可知，不同發酵溫度對菌株GSBM05的活菌量和發酵液抑菌活性均有較大影響，在28～32 ℃時活菌量較高，在 30 ℃ 時達到最大值，隨著溫度的升高，活菌量逐漸下降。在抑菌活性方面，在30 ℃時發酵液表現出較強的抑菌活性。在20、40 ℃時，抑菌活性較低。溫度過高或過低均不利于菌株GSBM05的生長和抑菌物質的產生，因此，選擇30 ℃作為最適溫度。

2.2.6 轉速對菌株生長和抑菌活性物質產生的影響 由圖9可知，當轉速為90～150 r/min時，隨著轉速的增加，菌體的活菌量和發酵液抑菌活性均逐漸增加，并在150 r/min時達到最大值。當轉速超過150 r/min時，菌體的活菌量和發酵液的抑菌活性逐漸下降。因此，選擇150 r/min作為最佳轉速。

2.3 優化培養條件與原始條件抑菌活性對比

由圖10可知，原始條件下測得菌株GSBM05發酵液對葡萄白腐病病菌的抑菌圈直徑為15.1mm，利用優化后的最佳培養條件(培養基配方為2.0%可溶性淀粉、2.0%豆粕、3.0%酵母粉、0.3% NaCl、0.3% CaCO3，初始pH值為7.0，裝液量為 90 mL/250 mL三角瓶，接種量為6%，在150 r/min、30 ℃ 條件下振蕩培養72 h)培養菌株GSBM05，測得其發酵液對葡萄白腐病病菌的抑菌圈直徑達25.2 mm，與原始條件相比提高66.9%。

2.4 菌株GSBM05發酵液抑菌活性穩定性的測定

由圖11可知，在溫度穩定性方面，經60 ℃處理后抑菌圈直徑依舊高達20 mm，隨著溫度的升高，菌株GSBM05發酵液抑菌活性逐漸降低，在120 ℃處理30 min后，抑菌物質失去活性；在酸堿穩定性方面，菌株GSBM05發酵液經不同pH值處理后均具有抑菌活性，在pH值為7.0、9.0時抑菌活性較高；菌株GSBM05發酵液在紫外線下照射不同時間后，抑菌活性均維持在較高水平，說明菌株GSBM05發酵液具有較好的紫外穩定性。

3 討論與結論

芽孢桿菌在發酵中可以產生抗生素類物質如表面活性素[9]、依枯草菌素[10-11]、泛革素[12]等物質，另外，還能產生細菌素、細胞壁降解酶等拮抗蛋白類物質[13]。芽孢桿菌次生物質的產生受到培養基成分及發酵條件的影響。不同培養基成分和發酵條件可顯著影響菌株生長和代謝物質的產生。盧彩鴿等的研究表明，在優化后的培養基和培養條件下，解淀粉芽孢桿菌MH71對番茄灰霉病的抑菌能力提高了37.4%[14]。洪鵬等優化后的解淀粉芽孢桿菌HF-01發酵液抑菌能力提高了37.3%[15]。

本研究通過單因素試驗對GSBM05菌株產抗菌物質的最佳碳源、氮源、無機鹽等進行篩選，結果表明，在不同碳源、氮源、無機鹽等條件下，菌株生長量與抑菌物質活性呈正相關。可溶性淀粉作為碳源有利于菌株GSBM05生長和抗菌物質產生，而該菌株對檸檬酸和甘油的利用效果較差。氮源中，有機氮利于菌株生長和活性物質產生，在銨態氮源中菌株生長受到抑制。通過正交試驗得到GSBM05菌株高產抗菌物質的最優培養基配方為2.0%可溶性淀粉，2.0%豆粕，3.0%酵母粉，0.3% NaCl，0.3% CaCO3。優化培養基中所含的5種成分均是生產上容易獲得的價格相對低廉的化工原料。這為今后大量生產抑菌物質提供了先決條件。利用優化的培養基在不同條件下培養得到的最適發酵條件：pH值為7.0，裝液量為90 mL/250 mL三角瓶，接種量為6%，搖床轉速為 150 r/min，培養溫度為30 ℃，培養時間為72 h，優化后抑菌活性提高了66.9%。在優化培養條件方面，菌株生長量與抗菌物質產量的變化并不完全一致，在測試的各因素中，培養時間對GSBM05菌株產抗菌物質影響最大。培養到48 h時，菌體含量達到最大值，但抑菌圈直徑在72 h時達到最大值，隨著發酵時間的延長，菌體含量明顯下降，而抗菌物質卻下降不明顯，說明其產抗菌物質的峰值時間出現在生長衰退期。

發酵液穩定性在甲基營養型芽孢桿菌中研究較少。本試驗的結果表明，GSBM05菌株在液體發酵培養中產生的抑菌物質具有較好的穩定性，紫外線照射對抑菌物質基本沒有影響，當溫度超過100 ℃時，抑菌活性顯著降低甚至失活，發酵液在pH值為3.0～11.0處理后依然保持較高的抑菌活性。說明溫度對GSBM05菌株抑菌物質活性影響較大。這與李穎等研究的枯草芽孢桿菌SH-1發酵液穩定性[16]相符。但侯寶宏等研究發現，解淀粉芽孢桿菌TS-1203產生的抗菌物質粗提物在120 ℃仍具有活性[17]。說明不同芽孢桿菌發酵液的溫度穩定性不盡相同。

發酵培養基優化是微生物發酵產品向產業化轉入的重要環節。本研究僅對甲基營養型芽孢桿菌GSBM05的培養基組成和培養條件進行了搖瓶發酵的初步研究，接下來還須要進一步通過發酵罐放大試驗來驗證發酵參數，為工業化生產提供依據。