地楓皮內生真菌DFP-G-7的分離鑒定、生物學特性及抑菌活性

孫文斌， 黃小京， 馮蓓蓓， 湯夏安， 駱海玉， 鄧志勇， 鄧業成

(珍稀瀕危動植物生態與環境保護省部共建教育部重點實驗室/廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林 541006)

長期以來，植物病害的防治主要依賴化學藥劑。但由于病原菌抗藥性的產生，化學藥劑防效大大下降，并且嚴重污染環境和農副產品，危害人畜健康，因此篩選植物內生有益微生物來防治植物病害成為研究熱點[1]。植物內生真菌(endophytic fungi)是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內部，而不使宿主植物出現明顯感染病害的真菌[2]。該類真菌具有促進宿主生長[3-4]、提高宿主抗病[5-6]、抗脅迫[7-8]及他感能力[9]等作用，為尋找綠色環保的微生物源農藥提供了新的資源。

地楓皮(Illiciumdifengpi)別稱楓榔、矮頂香，為木蘭科八角屬植物，是廣西巖溶石灰巖石山一種特有的中藥材[10]，屬國家Ⅲ級重點保護珍稀瀕危植物[11]。地楓皮是一種廣西特色壯藥，其莖皮和根皮具有祛風除濕，行氣止痛等功效，臨床常用于風濕關節痛、腰肌勞損和跌打損傷等癥狀治療，療效好，藥用價值高，是多種中成藥產品的主要原材料[12]。由于其分布區狹窄，野生資源蘊藏量少，加上其生存環境惡化及多年來產區群眾亂采濫挖，種群數量越來越少，在很多地段瀕臨滅絕或已絕跡。到目前為止，國內外對地楓皮內生真菌的研究尚屬空白，使地楓皮內生菌資源未能得到開發利用。本研究在2017年3月采自中國科學院廣西植物研究所的地楓皮根中分離鑒定內生真菌，并對其生物學特性和生防價值進行初步研究，旨在為地楓皮內生真菌在農用抗菌劑領域的開發利用奠定基礎。整個試驗全部在廣西師范大學珍稀瀕危動植物生態與環境保護省部共建教育部重點實驗室完成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 地楓皮(Illiciumdifengpi)植株采自中國科學院廣西植物研究所。

1.1.2 供試菌株 8種農業重要植物病原真菌：玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、茶輪斑病菌(Pestalotiopsistheae)、甘藍黑斑病菌(Alternariaoleracea)、甘蔗鳳梨病菌(Ceratocystisparadoxa)、貢柑鏈格孢菌(Alternariacitri)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、水稻胡麻葉斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)、煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)。貢柑鏈格孢菌(Alternariacitri)由廣西特色作物研究院提供，其余全部由廣西大學農學院植物病理室提供。

1.2 方法

1.2.1 地楓皮內生真菌DFP-G-7的分離純化 取地楓皮的健康地下根組織，先用流水沖洗干凈表面的泥土，切2 cm小段，無菌水漂洗3次，75%乙醇浸泡3 min，2%次氯酸鈉浸泡2 min，75%乙醇浸泡5 min，無菌水漂洗3次，將處理好的小段放置在已滅菌的PDA平板上，暗培養5～7 d后，挑取組織周邊的菌絲進行純化，直到最終純化得到單一菌株為止。消毒可靠性檢驗：用組織印跡法和最后一次的漂洗液檢查消毒效果。具體操作步驟：用滅菌鑷子夾住已消毒過的地楓皮根段，使其表面分別與PDA平板接觸3 min后取出，放置于與內生真菌分離平板相同的條件下進行培養，觀察培養基上是否有菌落生長。取最后一次的漂洗液100 μL，添加到已滅菌的PDA平板上，用涂布棒涂布均勻，放置于與內生真菌分離平板相同的條件下進行培養，觀察培養基上是否有菌落生長。

1.2.2 地楓皮內生真菌DFP-G-7的鑒定 采用形態學和分子生物學相結合的方法，對具有顯著抗植物病原真菌活性的內生真菌菌株進行鑒定。形態鑒定主要根據其菌落形態、菌絲及孢子特征，對其進行初步鑒定。分子鑒定主要利用真核生物在rDNA的ITS區段的特性，即具保守性序列和特異性序列的特性，通過內生真菌的rDNA-ITS序列對其進行鑒定。采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取內生真菌的總DNA，以真菌通用引物ITS1和ITS4進行18S rDNA擴增，最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并純化，并由北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進行測序。將測序得到的結果進行校對拼接后登錄GenBank進行全序列比對(Blast)，找出相似性最高、親緣關系最近的真菌作為參考序列，并用MEGA 7.0.26軟件和Clustalx 1.83軟件進行系統發育分析，構建系統發育樹。

1.2.3 地楓皮內生真菌DFP-G-7的生物學特性

1.2.3.1 不同溫度對菌絲生長的影響 將內生真菌DFP-G-7活化后，用0.4 cm灼燒后滅菌的打孔器在其邊緣打出直徑0.4 cm的菌落，接種到PDA平板上，分別放到5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養箱中培養，培養7 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3次重復。

1.2.3.2 不同碳源對菌絲生長的影響 不同碳源培養基為配方改良的PDA培養基，將不同碳源包括甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖替代葡萄糖，制備不同碳源培養基，碳源添加量為20 g/L，接種菌株DFP-G-7后(接種方法同“1.2.3.1”節)，置于25 ℃恒溫培養箱中培養。培養7 d后，采用十字交叉法測定菌落直徑。每個處理3次重復。

1.2.3.3 不同氮源對菌絲生長的影響 氮源培養基為改良PDA培養基，添加氮源為2 g/L。供試氮源為酵母膏、甘氨酸、蛋白胨、硝酸鈣、硫酸銨、硝酸銨，制備不同氮源培養基，將DFP-G-7接種到平板上(接種方法同“1.2.3.1”節)，置于25 ℃恒溫培養箱中。培養7 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個重復處理3次。

1.2.3.4 不同pH值對菌絲生長的影響 用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉將PDA培養基的pH值分別調制4、5、6、7、8、9、10，接種DFP-G-7菌菌落到改良的PDA平板上(接種方法同“1.2.3.1”節)，置于25 ℃恒溫培養箱中培養。培養7 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 地楓皮內生真菌DFP-G-7對植物病原菌的抑制作用 采用平板對峙培養法[13]，測定菌株DFP-G-7對8種植物病原菌的抑制活性，具體方法如下：將活化好的內生真菌和植物病原菌，用無菌打孔器分別在內生真菌和病原菌菌落邊緣切取大小為0.4 cm的圓形菌餅，置于同一PDA平板培養基中，內生真菌和病原菌的菌絲塊處在同一直線的兩點上，且兩點相距4 cm。在平板背面標記好相對應的菌落名稱、日期等。

對照試驗：同時以在另一個空白平板的相同位置只接種病原菌作為空白對照，且處理和對照均設3個重復。于26 ℃培養箱中恒溫培養3～7 d，同時每天觀察處理組和對照組病原菌菌落以及菌絲生長速度、菌落之間是否有抑菌帶出現、菌落邊緣菌絲是否有稀疏和萎縮畸形等現象發生。待病原菌的菌落不再擴大時用刻度尺測量處理組病原菌菌落生長半徑r病和對照組病原菌生長半徑r0。抑菌率計算公式：

抑菌率=(r0-r病)/r0×100%。

1.2.5 統計軟件 試驗所得數據采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行差異顯著性分析(Duncan’s)，GraphPad Prism軟件作圖，MEGA 7.0.26軟件和Clustalx 1.83軟件進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 DFP-G-7的鑒定及系統發育分析

2.1.1 DFP-G-7形態學特征 該菌菌落生長較快，9 d菌落直徑可達到5.86 cm，菌絲表面為白色，邊緣整齊，背面淡米黃色，不透明，無水溶性色素，較易挑取。分生孢子很豐富，大分生孢子鐮刀形，4隔，長度在27.46 μm左右，小分生孢子近圓形。菌絲有隔，分生孢子梗有分支。初步鑒定為子囊菌綱肉座菌目叢赤殼科鐮刀菌屬真菌(圖1)。

2.1.2 DFP-G-7系統發育分析 通過18S rDNA的ITS序列對DFP-G-7進行鑒定。將測序得到的結果在NCBI經過Blast比對，發現其ITS序列和Fusariumnematophilum的相似性最高，相似度達到99%，在GenBank中的登錄號為KX171631。在Blast比對結果中選取相似度較高的幾組序列，應用Clustalx 1.83軟件對序列進行完全比對并將序列對齊，用MEGA 7.0軟件采用鄰位相連法構建系統發育樹，自展檢驗(Bootstrap)重復1 000次獲得的數值標記在分支上(圖2)。由圖2可知，DFP-G-7和F.nematophilum以99%的可信度聚在同一分支上，與經形態學鑒定的結果一致。綜合上述結果分析，將該內生真菌DFP-G-7鑒定為鐮孢屬真菌F.nematophilum。

2.2 地楓皮內生真菌DFP-G-7的生物學特性

2.2.1 不同碳源對DFP-G-7生長的影響 以PDA培養基為基礎，經6種不同的碳源培養9 d后，該菌株能夠較好地利用這6種碳源，其中，對甘露醇的利用率最高，對乳糖的利用率最低(圖3)。該菌對碳源的要求并不嚴格，6種碳源并沒有顯著表現出對該菌的抑制或者促進生長，但可以看出甘露醇為該菌生長的最佳碳源。

2.2.2 不同氮源對DFP-G-7生長的影響 以PDA培養基為基礎培養基，經6種不同氮源培養9 d后，6種氮源中無論是有機氮，還是無機氮，對于DFP-G-7的生長影響均較小(圖4)，說明DFP-G-7對于氮源的要求較低，在有機氮和無機氮中都可以正常生長。

2.2.3 不同溫度對DFP-G-7生長的影響 以PDA培養基為基礎，設置7個溫度梯度，分別是5、10、15、20、25、30、35 ℃，置于25 ℃恒溫培養箱9 d。由圖5可知，在10～30 ℃之間，DFP-G-7菌落均可以生長，25 ℃時生長最好，菌落直徑可以達到5.63 cm。該菌在5、35 ℃基本不生長。

2.2.4 不同pH值對DFP-G-7生長的影響 以PDA培養基為基礎，分別用1 mol/L的HCl和NaOH溶液設置7個pH值，分別是4、5、6、7、8、9、10。由圖6可知，該菌在pH值為4～10之間均可生長，在偏酸性的環境下生長較慢，受到一定程度的抑制作用，在中性偏堿性的條件下，菌絲生長旺盛，在pH值為7時菌落直徑達到生長最大值，為5.83 cm，說明該菌適宜在中性環境中生長。

2.3 地楓皮內生真菌DFP-G-7對植物病原菌的抑制作用

采用平板對峙法對8株常見的植物病原真菌進行拮抗試驗，試驗結果(表1)表明，內生真菌DFP-G-7對8株常見的植物病原真菌有不同程度的抑制作用，其中對茶輪斑病菌、辣椒炭疽病菌和甘藍黑斑病菌的拮抗作用大，抑制率達到44.28%～50.64%，對煙草黑脛病菌的拮抗作用最小，抑制率只有11.45%。

表1 DFP-G-7對8株植物病原菌的拮抗作用

注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上有顯著性差異。

3 討論

目前有關廣西特色壯藥地楓皮內生真菌的研究尚未見報道。本試驗首次對地楓皮內生真菌進行分離鑒定并對其抑菌活性和生物學特性進行了初步研究。通過組織分離法，從地楓皮的根、莖、葉中共分離得到內生真菌30株。通過平板對峙法對其中20株內生真菌進行抑菌活性篩選，篩選得到DFP-G-7對8種植物病原菌有較廣譜抑菌活性，其余10株未進行篩選的原因是其生長速度緩慢，不適合該方法。以上研究結果表明，廣西特色壯藥地楓皮植株中存在具有顯著、廣譜抗菌活性的內生真菌，從廣西特色壯藥地楓皮中分離和篩選具有抗菌活性的內生真菌對生防菌株的發現和生物源殺菌劑的開發利用將具有十分重要的意義。

采用形態學和分子生物學手段對內生真菌DFP-G-7進行鑒定，從形態學上可以看出其大分生孢子為鐮刀形并且有4～5個隔，又經18S rDNA測序得到1條長度為549 bp的片段，在NCBI經Blast比對其與F.nematophilum的相似度為99%，通過構建系統發育樹可知其與F.nematophilum在同一分支的支持率為99%，故將其歸為鐮刀屬(Fusarium)的真菌F.nematophilum。鐮刀屬真菌是常見的植物內生真菌，具有多種活性成分，在植物中廣泛存在，并不引起植株組織病害。Tayung等從紅豆杉樹皮中分離到1株具有抑菌作用的腐皮鐮刀菌[14]；Barik等從菖蒲根中分離到1株內生尖孢鐮刀菌，對臨床病原菌具有很好的抑制作用[15]。

通過對DFP-G-7生物學特性的研究表明，DFP-G-7對碳源和氮源影響并不敏感。溫度對DFP-G-7的生長的影響較大，其最適宜生長的溫度為25 ℃，在5 ℃和35 ℃均處于不生長的狀態。DFP-G-7對酸堿度的適應能力較強，在pH值6～10范圍內均能生長良好，pH值4～5范圍內生長較差。

本試驗只對DFP-G-7的種屬關系與生物學特性和抑菌活性進行了研究，這僅是為以后的工作打下基礎，今后將對其次生代謝產物進行深入研究，通過活性追蹤分離出主要的抑菌活性物質并探明其抑菌機制。