環境中氨基脲的高通量酶聯免疫法檢測

朱暖飛， 董帥兵， 張 禎

(江蘇大學環境與安全工程學院，江蘇鎮江 212013)

硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，由于其對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌、原蟲等病原體都有強烈的殺滅作用[1-4]，被廣泛應用于畜禽及水產養殖業[2，5-9]。常見的硝基呋喃類藥物有呋喃西林、呋喃唑酮等，其結構式如圖1所示。然而，研究表明，這種藥物及其代謝物是一類具有潛在的致癌、致畸和致突變的物質[4，10-13]。目前我國已將呋喃西林等列為禁用藥，禁止在食品工業中使用該類藥物，并將其列入首批《獸藥地方標準廢止目錄》中。但由于此類藥物價格低廉、治療效果佳，非法使用仍然存在。

硝基呋喃類藥物在動物體內的代謝非常迅速，半衰期短，因此這類藥物不易被檢測，但由于此類物質的代謝產物容易和生物體內的蛋白質結合，形成穩定的化合物殘留在動物體或人體當中[10，14-17]，因此，通常通過對硝基呋喃類抗生素的代謝物的研究來推斷硝基呋喃類物質的殘留情況。氨基脲(SEM)是呋喃西林的特征性代謝產物，以SEM作為標示物可以檢測呋喃西林的殘留[18-19]。考慮到呋喃西林大量使用，可能導致SEM在環境中的廣泛存在。所以，建立簡單、靈敏、可靠的分析方法，不但可以調查環境中SEM的殘留現狀，進而評估其生態風險，而且有助于推斷畜禽及水產養殖業中呋喃西林的使用狀況。目前對于SEM的檢測方法主要集中于儀器分析方法，如氣相色譜-質譜法、LC-MS/MS等[2-4，20-26]，雖然這些方法靈敏度高、準確性好，但是由于存在測試成本高、分析時間長、檢測所需樣品量大(通常>500 mL)及前處理步驟繁瑣等不足，并不能實現在較大范圍內系統、全面、快速分析樣品中SEM的含量。與此相比，酶聯免疫法(ELISA)具有操作簡便、檢測成本低、高通量的特點[26-28]，可用于環境中此種痕量污染物的分析。

因此，本研究利用實驗室所制備的可特異性識別SEM的單克隆抗體，建立了一種高靈敏度、高通量的間接競爭酶聯免疫分析方法(IC-ELISA)，并以此對江蘇省鎮江地區水體與土壤中SEM的污染狀況進行了調查研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基脲SEM抗原、抗體由筆者所在課題組制備；氨基脲標準品、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺均購自美國Sigma公司；吐溫-20(Tween-20)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、濃硫酸(H2SO4)明膠等購自阿拉丁化學試劑有限公司，且均為分析純；96孔酶標板購自丹麥NUNC公司。

碳酸鹽包被緩沖液(CBS)為0.05 mol/L碳酸氫鈉和碳酸鈉溶液，pH值為9.6；封閉液為含1%明膠的CBS緩沖液；洗滌液為含體積分數0.05% Tween-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4；抗體稀釋液為含0.01% Tween-20、0.1%明膠的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4；顯色液為500 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺溶液、10 mL檸檬酸鈉緩沖液、32 μL 0.75%過氧化氫，用時混合；終止液為2 mol/L硫酸溶液。

1.2 儀器設備

電子分析天平、恒溫培養箱、多功能酶標儀分別購自重慶CoiC公司、上海精密試驗設備有限公司和瑞士Tecan公司。

1.3 間接酶聯免疫分析法試驗條件的優化

根據棋盤滴定法測定原則，選取吸光度D值為1且斜率最大的抗原、抗體濃度組合為本試驗中抗原最佳包被濃度、抗體最佳稀釋濃度，同時，為了使該方法的檢測效果達到最佳，對反應體系甲醇含量、離子強度、pH值3個影響因素進行篩選優化。

1.4 間接酶聯免疫分析法的建立

在最優試驗條件下建立方法，具體操作步驟如下：

(1)包被：用包被液稀釋SEM包被原加至96孔酶標板中，100 μL/孔，4 ℃ 12～16 h或37 ℃ 2 h孵育。(2)洗滌：傾去孔內多余液體，用新配制的洗滌液洗滌5遍，200 μL/孔，在吸水紙上將板拍干。(3)封閉：150 μL/孔加入封閉液，37 ℃孵育45 min。(4)洗滌：傾去孔內液體，用新配制的洗滌液洗滌3遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干。(5)競爭：加入不同濃度的標準品或樣品和抗體，各50 μL/孔，37 ℃孵育30 min。(6)洗滌：傾去孔內液體，用新配制的洗滌液洗滌5遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干。(7)加入酶標二抗：加入辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育30 min。(8)洗滌：傾去孔內液體，用新配制的洗滌液洗滌，200 μL/孔，共洗5遍，在吸水紙上拍干。(9)顯色：加入新鮮配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，避光顯色5 min。(10)終止：加入終止液，50 μL/孔。(11)測定：使用多功能酶標儀讀取各孔 450 nm 下的吸光度。

1.5 空白加標和樣品加標試驗

1.5.1 樣品前處理 水樣處理：取10 mL水樣，抽濾，向其中加入8 mL正己烷，恒溫振蕩6 h，離心2 min，取上清，氮吹至近干，用2 mL甲醇復溶。

土壤樣品處理：取5 g土壤樣品，烘干至恒質量，向其中加入10 mL正己烷，恒溫振蕩12 h，高速離心5 min，取上清，氮吹至近干，用2 mL甲醇復溶。

1.5.2 加標試驗 空白加標試驗：取一定量的蒸餾水或自來水或空白土壤，向其中添加線性范圍內低、中、高3個濃度的SEM標準品，每個水平設置3個平行重復孔，根據“1.4”節中建立的間接競爭ELISA法進行測定。將測定結果代入標準曲線，計算濃度，并根據公式(1)計算添加回收率。

空白回收率=測定量(μg/L)/加標量(μg/L)×100%。

(1)

樣品加標試驗：取相同的樣品2份，其中1份加入定量的標準物質；將2份樣品按相同的分析步驟進行分析。將測定結果代入標準曲線，計算濃度，并根據公式(2)計算添加回收率。

樣品回收率=[測定量(μg/L)-樣品量(μg/L)]/加標量(μg/L)×100%。

(2)

1.6 樣品測定

根據“1.5.1”節進行樣品前處理，根據“1.4”節中建立的間接競爭ELISA法進行樣品測定，最后將測定結果代入標準曲線，計算樣品濃度。

2 結果與分析

2.1 試驗條件的優化

ELISA是一種經典的分析方法，其靈敏度由多種因素決定。優化反應條件和體系各種參數對于靈敏度的提高極其必要。本研究對體系甲醇含量、pH值和離子濃度3個方面進行了優化，并以IC50值和Dmax/IC50作為優化結果的評判標準。

從圖2-A可以看出，反應體系加入甲醇后，該方法的IC50值迅速上升，這意味著甲醇的加入損壞了方法的靈敏度，因此本檢測體系剔除了甲醇。同樣，當體系中緩沖液的pH值為7、Na+濃度為0.3 mol/L時，該方法的IC50值和Dmax/IC50達到最佳值(圖2-B、圖2-C)。基于此，建立該方法的標準曲線(圖3)，其線性范圍為0.179～8.627 μg/L，IC50值為 0.967 μg/L，檢測限可達到0.059 μg/L。

2.2 加標回收試驗

為了驗證方法的準確性，本研究進行了加標回收試驗(表1、表2)，空白加標回收率在81.9%～105.6%之間，變異系數均小于5%；樣品加標回收率在83.0%～104.0%，變異系數均小于5%，證明該方法具有良好的重現性和準確度，符合檢測要求，可用于實際樣品的分析。

2.3 鎮江地區水體及土壤樣本的測定

硝基呋喃類藥物經生物體代謝后，一部分與生物體中的蛋白質結合，穩定存在于動物機體內，另一部分則被排泄到體外，進入環境中[29-30]，SEM結構穩定，進入到環境中不易降解且有較強的生物富集性，其蓄積效應會對水生生態系統高營養級生物產生毒性和危害[29]。

表2的分析結果可以看出，在鎮江地區的2條主要支流——玉帶河與團結河均檢出了SEM的殘留，濃度分別為 0.431 μg/L 和1.325 μg/L，團結河附近土壤的含量為 0.205 ng/g。2處河流周圍均無畜禽及水產養殖場，其來源可能是該物質通過食物鏈進入人體，隨著生活污水等方式釋放到環境中。濃度為μg/L級的SEM持續暴露可嚴重損害水生系統中的敏感菌，嚴重影響水生系統的平衡。SEM對環境的負作用是慢性、長期和累積性的，它們可以通過生物累積和食物鏈的傳遞而最終導致對高等動植物和人類的危害。同時，從環境水體與土壤中殘留量的結果可以看出，目前仍有一定量的硝基呋喃類抗生素的非法使用。

表1 IC-ELISA空白加標回收試驗

注：ND表示未檢出。下表同。

表2 IC-ELISA樣品測定和樣品加標回收試驗

3 結論

本研究建立了一種高靈敏、高通量快速檢測環境中SEM的間接競爭酶聯免疫分析方法(IC-ELISA)，方法的線性檢測范圍為0.179～8.627 μg/L，檢測限可達0.059 μg/L。該方法具有良好的重現性和準確性。利用此方法對鎮江地區環境水體與土壤中SEM的殘留狀況進行調查研究，在部分河流與土壤中檢出了此種污染物。相關結果將為研究環境中SEM的污染狀況和生態風險評估提供技術支撐。