濕法糖基化改性玉米醇溶蛋白的物化特性及其在膠囊殼中的應用

張慧君 陳又銘 沙迪昕 姜寧寧 王文霞 宮春宇

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，齊齊哈爾 161006)

玉米醇溶蛋白(zein)是玉米淀粉工業中濕法加工的副產物——玉米黃粉中的重要蛋白質，因其富含疏水性氨基酸，缺少必需氨基酸，早期常作為工業廢料排放，目前主要制成動物飼料外銷［1］。然而，玉米醇溶蛋白雖然工業附加值較低，但具有良好的成膜特性［2］。國內外對其研究已經持續多年，尤其在制備果蔬和肉制品保鮮涂膜方面進行了一些研究和應用實驗［3－5］。卻幾乎沒有得到工業化生產和實際商業應用。這主要是因為純玉米醇溶蛋白的膜質較脆，易斷裂，機械力學穩定性很差，不能滿足作為包裝材料的力學強度以及產品貨架期等要求［6］。

目前，提高植物蛋白膜機械性能的常用方法為塑化改性［7－9］，但是這種添加塑化劑的改性方法存在化學試劑殘留、形成有毒的氨基酸衍生物和改變營養價值等弊端［10］。蛋白質的糖基化改性僅通過加熱就能促使糖基化反應自發地進行［11］，接枝產物具有一定的安全性和可操作性，通常包括固相體系的干熱糖基化和液相體系濕熱糖基化［12］。其中濕熱糖基化具有反應時間短，速度快等優點，它是將蛋白質和單糖或低聚糖的緩沖溶液直接加熱進行反應，反應結束迅速冷卻，再冷凍干燥得到共價交聯產物，這種形成新結構的交聯產物可較好地改善其功能特性。孔繁惠等［13］采用葡萄糖對玉米醇溶蛋白進行濕法糖基化改性，結果顯示改性后的玉米醇溶蛋白溶解度比原來提高了1.84倍。劉娟等［14］研究用葡聚糖對酪蛋白進行糖基化改性，改性產物的乳化性比原來提高了1.5倍。PHAM等［15］利用在真空中糖基化的新技術將葡萄糖共價連接到胰蛋白酶和糜蛋白酶的Lys殘基上，與未糖基化者相比，糖基化的這兩種酶的熱穩定性顯著增強。

麥芽糖漿(Maltose Syrup，MS)作為一種食品常用的甜味劑，價廉易得。本研究麥芽糖漿對玉米醇溶蛋白進行濕熱法糖基化改性，提高其機械強度，利用得到的交聯產物zein－MS制備膠囊殼，擴大玉米醇溶蛋白在醫藥和保健食品領域的廣泛應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白(70%乙醇提取，蛋白質量分數90%):自制;麥芽糖漿，中糧公主嶺生化能源有限公司;辣根過氧化物酶、低分量蛋白標樣:上海生物生工有限公司;十二烷基硫酸鈉:天津市耀華化學試劑公司;β－巰基乙醇:天津市北聯精細化學品開發公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

QTS－25質構儀;Q－20DSC差示掃描量熱儀;FI－IR/NIR傅里葉變紅外光譜分析儀;s－3400掃描電子顯微鏡;WSL－1000D超聲波信號發生器;LYOQUEST－85真空冷凍干燥機;GBCY01數顯膜測厚儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖基化反應產物

用70%乙醇溶液溶解，配制成8% 玉米醇溶蛋白乙醇溶液，按照玉米醇溶蛋白∶MS質量比為9∶1的比例加入麥芽糖漿，混勻，調節體系pH，取變幅桿φ6、功率400 W超聲10 min，70℃磁力攪拌15 min，冷卻(4℃)，終止糖基化反應。

1.3.2 膜和膠囊殼的制備

稱取糖基化改性產物zein－MS用70%乙醇溶解配成8%的樣品溶液，在70℃下磁力攪拌30 min進行溶膠。如制備膜則將溶膠倒入不銹鋼模具置于70℃烘箱烘干成膜;如制備膠囊則將溶膠在預熱70℃的涂有植物油的1#膠囊殼模具上進行蘸膠，烘干后，取出拔膠囊殼。最后將烘干后的膜或將囊殼在30℃，相對濕度為43%干燥器內平衡48 h，進行測定。

1.3.3 蛋白膜抗拉強度的測定

將膜剪成4 cm×1 cm的矩形長條，置于質構儀拉伸探頭上，固定好，夾距設定為20 cm，拉伸速度為5 mm/s。計算如下式:

式中:TS為抗拉強度/MPa;F為最大拉力/N;L為膜樣品的厚度/mm(測厚儀在膜上均勻去10個點，準確測定其厚度，取平均值);W為膜樣品的寬度/mm。

1.3.4 玉米醇溶蛋白改性后的SDS－PAGE凝膠電泳測定

1.3.4.1 樣品制備

分別配制3 g/L的玉米醇溶蛋白、zein－MS蛋白溶液，取20 μL溶液于1.00 mL離心管中與樣品緩沖溶液(0.5 mol/L Tris－ HCl，pH 6.8、甘油、10%SDS、0.1%溴酚蘭、β－巰基乙醇、雙蒸水)1∶1混合，10 000 r/min離心5 min，取上清液沸水浴中煮沸5 min后，冷卻備用。

將粉末狀的低分子質量蛋白和辣根標樣直接用200 μL 雙蒸水和200 μL 2 × 樣品緩沖液(0.5 mol/L pH 6.8 Tris－ HCl 2.0 mL、甘油 2.0 mL、10%SDS 4.0 mL、0.1%溴酚蘭 0.5 mL、β － 巰基乙醇 1.0 mL、雙蒸水 0.5 mL)溶解，分裝在離心管中，每管 20 μL，沸水浴中煮沸5 min后，冷卻備用。

1.3.4.2 電泳實驗

分別配制質量分數為12%的分離膠和5%的濃縮膠。首先灌分離膠，水封，30 min后棄去水。灌濃縮膠，30 min后梳膠，置于電泳槽內，注入電極緩沖液。每孔進樣量為10 μL，連接電泳儀，恒壓控制，濃縮膠上所置電壓為80 V，當染料前沿進入分離膠后，電壓將提高到設定120 V，當樣品帶遷移到距離膠板底部1 cm左右，關閉電源。

1.3.4.3 染色和脫色

玉米醇溶蛋白染色和脫色:蛋白質樣品在電泳完畢，用固定液(含12.5%三氯乙酸，30%甲醇)固定1 h，然后將膠片放入染色液(含0.1%考馬斯亮藍R －250，10%甲醇，10%冰乙酸)染色2～4 h，然后用脫色液(冰乙酸∶甲醇∶水 =1∶1∶8)脫色 3 ～10 h，期間更換脫色液，至背景清楚。

zein－MS染色(PAS染色)和脫色:用糖蛋白固定液(12.5%三氯乙酸)固定膠片15 min，雙蒸水水洗2次，1%高碘酸氧化15 min，震蕩水洗5 min×3次，在希夫試劑避光染色，30 min，用脫色液(0.5%亞硫酸鈉)振蕩水洗5次，至條帶清晰。

1.3.5 蛋白膜紅外光譜掃描

采用FI－IR/NIR傅里葉變紅外光譜分析儀測試，掃描范圍在500 ～4 000 cm－1，分辨率 4 cm－1，掃描次數32次，對玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜進行掃描。

1.3.6 熱力學性質測定

準確稱取0.004 0 mg的玉米醇溶蛋白和zein－MS樣品，分別放入2個鋁制坩堝中，用壓蓋機壓蓋密封。利用差式掃描熱儀以10℃/min的升溫速度從25℃加熱至250℃。以樣品坩堝相同的空堝做對照參比，測定玉米醇溶蛋白和zein－MS的熱力學性質。

1.3.7 蛋白膜微觀結構測定

將玉米醇溶蛋白膜和zein－MS共價交聯產物膜，剪成0.5 mm2的實驗片，將樣品放入于掃描電鏡樣品座中，進行真空鍍金處理，加速電壓為15 kV，對樣品表面結構進行觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 不同種類膜抗拉強度比較

由于純玉米醇溶蛋白膜質較脆，不能滿足膠囊殼的力學性能，本研究采用麥芽糖漿對玉米醇溶蛋白進行濕法糖基化改性，并將傳統的明膠膜、玉米醇溶蛋白膜與zein－MS膜進行對比，結果如圖1所示。

對于硬膠囊殼，其抗拉強度值也并非越大越好，該值過大，失去硬膠囊的特點，變成軟膠囊。由圖1可知，傳統的明膠膠囊殼的抗拉強度(TS)為8.23 MPa，而純玉米醇溶蛋白膜的TS為4.67 MPa，實驗中在脫模即后期保存時易碎，達不到制備膠囊殼的力學要求。采用麥芽糖漿對玉米醇溶蛋白進行濕熱法糖基化改性，制備的zein－MS膜的抗拉強度有所提高，TS增加為9.22 MPa，說明糖基化改性過程中，玉米醇溶蛋白與MS發生了糖基化反應，使分子的羥基數量增加，改變了玉米醇溶蛋白的空間結構，成膜后結合的水分也增多，從而減少分子間的作用力，增加了分子鏈的流動性，使膜的柔韌性增強，膜抗拉強度得到提高［16－17］。

2.2 玉米醇溶蛋白改性后的SDS－PAGE凝膠電泳分析

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)是常規的蛋白質定性檢驗方法，染色多為考馬斯亮藍R－250，形成藍色條帶。而糖基化改性后得到的糖蛋白產物則使用高碘酸－Schiff(PAS)染色，得到粉紅色或淺紅色條帶。

圖2為玉米醇溶蛋白及其與麥芽糖漿進行共價結合后的考馬斯亮藍染色圖和Schiff試劑糖蛋白染色圖。由圖2可知，考馬斯亮藍染色1泳道的玉米醇溶蛋白和2泳道改性的zein－MS條帶的分子質量變化不明顯，這是因為麥芽糖漿是經α－1，4糖苷鍵連接兩個葡萄糖單位而成的雙糖，又稱為麥芽二糖，屬于小分子糖，因此，反應后的接枝產物分子質量變化不明顯，無法鑒定玉米醇溶蛋白是否與麥芽糖漿進行糖基化反應。以辣根過氧化物酶作為陽性對照，采用PAS染色，1’泳道的玉米醇溶蛋白在1泳道相同位置呈現淡淡的淺紅色條帶，與文獻一致［18］，證明純的玉米醇溶蛋白分子本身含有少量的糖。2’泳道的zein－MS呈現了相對顏色略深的紅色條帶，說明糖基化產物zein－MS分子中有糖基的存在，證明麥芽糖漿與玉米醇溶蛋白發生了糖基化反應，生成了蛋白質和糖的交聯產物。

圖2 SDS－PAGE考馬斯亮藍和糖蛋白染色圖

2.3 蛋白膜FT－IR分析

傅里葉紅外光譜是常用于分析蛋白結構的方法。蛋白質的特征吸收峰包括酰胺Ⅰ帶—NH彎曲振動(1 690～1 630 cm－1)、酰胺Ⅱ帶—NH彎曲振動(1 530～1 560 cm－1)和酰胺Ⅲ帶C—N彎曲振動和N—H彎曲振動(1 240～1 450 cm－1)。羥基的特征吸收峰有兩個，分別是—OH伸縮振動吸收峰(3 700～3 200 cm－1)和 C—O 伸縮振動吸收峰(1 100～1 000 cm－1)。

圖3為玉米醇溶蛋白與濕熱法糖基化產物zein－MS的傅里葉紅外光譜分析圖。相比未改性的玉米醇溶蛋白膜，酰胺Ⅰ帶的叔酰胺1 646 cm－1峰移至1 647 cm－1，振動吸收峰變小發生藍移，該藍移來自于糖基化反應后玉米醇溶蛋白的α－螺旋結構減少［19］;酰胺Ⅱ帶的仲酰胺1 537 cm－1峰和酰胺Ⅲ帶1 243 cm－1峰均未移動。這可能導致這樣的結果:相比純的玉米醇溶蛋白，濕法糖基化改性后的zein－MS引入了新的麥芽糖鏈導致接枝后產物的結構中變化。另外，當蛋白與糖分子共價交聯后，典型的特征就是羥基含量增加，在紅外光譜表現為羥基的特征吸收峰增強。圖3中改性的zein－MS膜在羥基伸縮振動吸收峰 3 290 cm－1峰移至 3 288 cm－1峰，1 024 cm－1生成了新的 C—O伸縮振動吸收峰，結果表明有新的羥基生成。綜上所述，傅里葉紅外譜圖證實原來玉米醇溶蛋白蛋白質經濕法糖基化后二級結構發生了變化，與麥芽糖漿產生了共價交聯，生成的新結構有助于提高蛋白膜的機械性能。

圖3 玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜的FT－IR光譜圖

2.4 熱性質分析

蛋白質在高溫下加熱，肽鏈受到較強的熱振蕩，蛋白質的次級鍵如氫鍵等收到破壞，打亂了分子內部有序排列，使蛋白質分子結構展開，具有玻璃態轉化行為。蛋白質肽鏈在展開過程中需要吸收能量，導致能量發生了變化［20］。濕法糖基化zein－MS的DSC掃描結果如圖4所示。

圖4 玉米醇溶蛋白和zein－MS的DSC圖

當玉米醇溶蛋白與麥芽糖漿發生了糖基化反應時，如傅里葉紅外譜圖所示，玉米醇溶蛋白的空間結構和鍵位次序都會發生相應的改變，使熱變性時吸收的能量發生變化。由圖4可知，玉米醇溶蛋白膜的熱變性溫度約188.56℃，而采用麥芽糖漿對玉米醇溶蛋白進行糖基化改性以后，改性后交聯產物的熱變性溫度上升至206.96℃，說明通過濕熱法對玉米醇溶蛋白糖基化改性，交聯后的糖蛋白內部結構更加穩定，從而提高了zein－MS的熱穩定性。

2.5 蛋白膜SEM分析

合格的膜表面結構要求盡可能少的裂紋，孔洞等現象，這些不良現象不僅會影響膜的外觀，尤其會導致膜機械性能變差。由圖5可知:1和1’為利用SEM對玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜放大1 000倍表面進行觀察的結果，玉米醇溶蛋白膜表面存在或大或小的微小孔洞結構，而經過濕熱法糖基化改性后的交聯產物zein－MS制備成膜后，觀察膜表面微孔結構消失，形成一些淺的凹陷，表面相對比較平整。當將玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜同時放大2 000、5 000和10 000倍時，觀察到了相同的結果，尤其是10 000倍可以看到玉米醇溶蛋白表面有一系列不規則大小的孔洞，zein－MS膜表面沒有孔隙，結構較光滑，但表面有深有淺，有凹陷，平整度略差。上述結果證明孔洞等缺陷是導致膜機械性能差的主要原因，即對膜的抗拉強度造成一定的影響。玉米醇溶蛋白經過麥芽糖漿濕熱法糖基化改性，麥芽糖漿分子和玉米醇溶蛋白分子發生共價接合，使膜的孔洞結構消失，消失的孔洞彌合時，使膜表面形成稍微的凹陷，提高了膜的機械性能。

圖5 玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜表面的SEM圖

表1 檢測指標

2.6 膠囊殼的制備

對改性后zein－MS進行溶膠，利用圖6所示的1號膠囊模具蘸膠制備出圖7所示的硬膠囊殼，按照《中華人民共和國藥典(2015版)》的標準在膠囊體和膠囊帽的外觀、松緊度、脆碎度、干燥失重、灼燒殘渣進行檢測，結果如表1所示。

圖6 1號膠囊模具

圖7 自制的膠囊殼

由表1可知，按照《中華人民共和國藥典(2015版)》的標準進行檢測，由玉米醇溶蛋白制備的膠囊殼由于脆性較大，膠囊殼在脫模過程中膠囊殼會有裂痕，甚至易碎、不完整，在外觀、松緊度、脆碎度和干燥失重等方面不合格。由zein－MS制備膠囊殼的各項檢測結果符合國家藥典標準，膠囊外觀沒有裂縫，無漏粉現象，表面光滑，質地均勻。另外膠囊其他指標，如松緊度、灼燒殘渣、脆碎度和干燥失重均合格。說明經濕熱法糖基化改性后，可有效改善玉米醇溶蛋白的脆性，制備膠囊殼符合國家藥典的指標，為植物蛋白替代動物明膠植物膠囊殼提供參考。

3 結論

玉米醇溶蛋白膜因其特殊的氨基酸組成，具有良好的成膜性，然而該膜脆性大，限制了它的應用，尤其是在食品和藥品中的應用。糖基化改性是一種降低玉米醇溶蛋白膜脆性，提高機械性能的有效方法。本研究以食品級的糖原麥芽糖漿為原料，通過濕熱法糖基化改性得到新的共價交聯結構產物zein－MS，該產物穩定性好，具有一定的抗拉強度，有效改善玉米醇溶蛋白膜的脆性，增強了機械性能，而且改性過程中和改性后沒有有害化學試劑殘留，安全性好，適合替代明膠制備膠囊殼。