慢性乙型肝炎肝組織中CD4+、CD8+T淋巴細胞的表達與肝竇及竇間隙病理病變的相關性研究

汪瓊，陳付涼

（1.蚌埠醫學院第一附屬醫院 感染科實驗室，安徽 蚌埠 233000；2.解放軍第123醫院 病理科，安徽 蚌埠 233000）

0 引言

慢性乙型肝炎發病和免疫功能具有密切相關性，免疫功能低下可能和患者的病毒無法清除有關，且機理較為復雜。細胞免疫于乙肝發病中有著重要作用，比如CD4+、CD8+細胞毒T淋巴細胞的增加對清除病毒有明顯作用，而T細胞功能低下則是乙肝慢性化的關鍵因素，但尚無明確機制。肝竇及竇間隙作為評價慢性乙型肝炎的重要物質，其與肝炎組織中CD4+、CD8+T淋巴細胞的表達可能有一定的聯系。因此，為了進一步研究慢性乙型肝炎肝組織中CD4+、CD8+T淋巴細胞的表達與肝竇及竇間隙病理病變之間的相關性，本文選擇60例CHB肝臟組織標本和10例正常人肝組織標本進行對比研究，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料

隨機選擇2013年7月至2016年12月蚌埠醫學院第一附屬醫院60例慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者肝臟組織穿刺標本，男41例，女19例；患者年齡在13-62歲，平均34歲,獲取的肝組織長度在1.5-2 cm之間。選取正常肝穿刺組織10例，排除HBsAg陽性。所有病例診斷均符合2015年《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準[1]。

1.2 試劑

免疫組化試劑盒為美國Maxin Biotech Inc產品。

1.3 標本采集與處理

獲得的60例CHB患者及10例正常肝組織制作病理切片，分別做蘇木素-伊紅染色（HE染色），CD4+、CD8+免疫組化染色，顯微鏡觀察。

1.4 方法

（1）免疫組化染色。染色方法嚴格按照說明書進行。

（2）CD4+、CD8+細胞陽性判斷方法。觀察CD4、CD8在肝組織中單個核細胞的染色深淺及分布范圍。不顯色為陰性（-）。染成棕黃色呈散在分布為陽性（+），染色細胞數每個高倍視野（400倍）單個核細胞≤20。單個高倍視野陽性部位細胞數＞20，呈彌漫性或片狀分布為強陽性（++）。每張切片隨機選5個高倍鏡視野，計算其陽性細胞數，取平均值。

（3）肝竇及竇間隙病理病變評分方法。我們選取肝竇阻塞、肝竇狹窄、肝竇毛細血管化三個指標來對肝竇的破壞進行評分。若無以上病變肝竇積分為0；有一種病變積分為1；有兩種病變積分為2；三種病理表現都有積分為3。

2 結果

統計學方法應用SPSS 17.0軟件處理數據，計數計量資料采用Pearson correlation統計學分析，P0.05被認為差異有統計學意義，見表1。

表1 肝竇病變積分與CD4+、CD8+陽性表達的關系

3 討論

CHB發病是HBV侵入，機體的免疫系統在對抗病毒入侵所引起的全身免疫系統改變及肝組織損傷的過程。研究表明[2]，細胞免疫在CHB發病及慢性化發展過程中起核心作用，而CD4+、CD8+在介導細胞免疫過程中擔當重要角色[3]。故機體肝組織中CD4+、CD8+的表達量，可能是機體細胞免疫狀況的較好反應。之前有學者關于外周血T淋巴細胞表達與肝組織損傷的相關性報道，但結果亦不相一致。筆者通過免疫組化染色直接半定量檢測肝組織中淋巴細胞亞群陽性率，觀察CD4+、CD8+T淋巴細胞在肝組織中的表達與限定的肝內毛細血管（肝竇）病理形態學變化，分析兩者之間存在的聯系，進一步了解HBV感染慢性化的機制。之前鮮有學者關于此類報道。

CHB患者肝臟血管病變是肝組織損傷的重要特征[4]，肝血管病變導致肝臟血液循環障礙，對肝組織及機體造成損害。肝臟血管炎癥導致其破壞及阻塞，引起血管增生、肝竇毛細血管化等肝血管的改建及結構異常，此過程多種免疫細胞參與介導，據研究表明[5]CD4、CD8是此過程中重要的分子基礎。故檢測肝組織中CD4、CD8表達，觀察肝組織中肝血竇的病變，對判斷患者的免疫狀態和肝組織的損傷程度大有助益。肝血竇的通透性較大，有利于肝細胞與血流之間進行物質交換，肝血竇內肝巨噬細胞（Kupffer cell），有較強的吞噬能力，為肝內重要的防御裝置。這與T細胞介導的免疫功能相近。正是肝竇的特殊結構及功能使其成為HBV經血液循環進入肝組織首先侵犯并復制的部位[4-5]。故CHB患者肝組織肝竇病理病變與T淋巴細胞表達可能存在一定聯系。以此為線索，筆者對入選的60例CHB患者和10例正常肝穿刺組織免疫組化染色，分析肝組織T淋巴細胞表達與肝竇病理病變積分之間的關系。

雖然CHB發病及慢性化的具體機制還不明確，但有一點是醫學界共識，HBV感染本身并不造成肝組織損傷，而是通過激發宿主免疫應答造成肝細胞毀損，肝組織損傷程度取決于病毒復制與及機體免疫應答和纖維化之間的穩態。有學者研究發現[6]，Tregs在外周血表達與肝組織炎癥程度（G）（S）之間存在負相關性。但也有持不同觀點的[7]，認為T淋巴細胞表達與肝組織炎癥程度（G），和纖維化程度（S）無相關性。我們研究發現，肝組織損傷在血管表現肝竇病理病變積分隨著CD4+、CD8+細胞陽性程度增強而加重（如圖1、2），統計學相關性分析得出P0.01，說明兩者之間存在顯著相關性。與裴豪等關于肝組織損傷的研究結果[8]相近。我們還發現，在肝竇病變積分為0的13例標本中10例來至正常對照組，3例是CHB患者，同樣T淋巴細胞表達陽性中亦有正常對照組標本，說明HBV侵入肝組織，T淋巴細胞已在肝組織中表達，感染初肝組織肝竇病理病變可無表現或病變較輕。這可能是CD4+、CD8+介導細胞免疫，在免疫抑制維持機體免疫穩態方面發揮作用。此期極少有臨床表現，但病毒復制活躍。調節性T細胞（Tregs）T細胞亞群可有多種表現型，無論何種Tregs表型，其作用的機制之一是通過分泌IL-10，TGF-β（轉化生長因子-β）等因子，抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞的過度活化和增殖[9]，發揮Tregs負性免疫抑制作用。可見CD4+、CD8+T淋巴細胞是Tregs維持機體穩態作用機制的最后通路。故肝組織中CD4+、CD8+T淋巴細胞表達可較準確的反應機體的免疫狀態。從實驗結果看，肝竇病變積分為2的25例患者中，CD4+、CD8+T淋巴細胞表達陽性及以上者20例，占比80%，說明肝組織肝竇病變在形態學上有明顯表現時，此時的肝組織T淋巴細胞表達較肝竇病變積分小者增強。此期機體免疫系統，特別是特異性細胞免疫系統發揮作用。

圖1 （CD4+肝細胞表達）

圖2 （CD8+肝細胞表達）

肝組織病理檢查中我們發現，若肝組織結構破壞嚴重，肝組織纖維化，可見假小葉，已分辨不清典型肝竇及竇周間隙組織結構，其肝組織CD4+、CD8+T淋巴細胞很少表達，且患者年齡偏高。我們推測，CHB患者HBV復制與機體免疫長期博弈中，特異性細胞免疫未能將HBV徹底清除，進入反復期，致使肝組織大面積毀損。此時外周血可能無法準確反映肝組織病變情況，臨床應盡早肝穿刺病理檢查，以免延誤病情。

綜上所述，望本實驗研究能為今后學者在CHB患者肝組織中T淋巴細胞表達與肝血管病變的研究方面提供幫助，為HBV慢性化機制提供佐證，為臨床治療CHB患者尋找合適方案。