苗藥啊咳知的超聲提取工藝考察△

范琳琳 伍天苔 王 繪 張 平 何 康

(貴陽中醫學院 貴州省苗醫藥重點實驗室，貴州 貴陽 550002)

苗藥啊咳知，為水龍骨科 (Polypodiaceae)石韋屬(Pyrrosia) 植物廬山石韋 (Pyrrosia sheareri (Bak.) Ching) 的全草。苗藥啊咳知在貴州苗族地區用于治療感染及腹瀉，在仡佬族用于抗感染以及在毛南族用于治療支氣管炎等。文獻顯示廬山石韋中含有綠原酸和芒果這2種有效成分[1,2]，具有抗菌抗炎和抗菌抗病毒等作用，能較典型的反映出該藥的主治和功效，且綠原酸為藥典的指標性成分。本實驗在他人研究成果上進一步探索[3-10]，建立一套科學的提取方案，為其資源的開發與應用提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100系列高效液相色譜儀(自動進樣器，紫外檢測器，四元泵：美國，安捷倫公司)，梅特勒-托利多New classic型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，多功能粉碎機(上海北申科技有限公司)。

1.2 試劑與試藥 甲醇為色譜純(天津市科密歐化學試劑開發中心)；水為二次蒸餾水；綠原酸對照品(購于西南麥克斯藥品純度≥98%，批號140718002)；芒果苷對照品自制，純度≥98%；廬山石韋藥材采自貴州道真，經貴陽中醫學院趙俊華教授鑒定為水龍骨科石韋屬植物廬山石韋(Pyrrosia sheareri (Bak.)Ching)藥材，曬干后用粉碎機將其粉碎，過50目篩，備用；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定綠原酸和芒果苷含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱phenomenex-C18(4.6×150mm，5μm)，流動相為乙腈(B)-0.2%磷酸水溶液(C)梯度洗脫，洗脫程序：0～10min，8%B；10～55min，50%B；55～65min，100%B；檢測波長為320 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取綠原酸、芒果苷對照品1mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品濃度為0.1 mg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱定廬山石韋藥材粉末0.5000g，加50%甲醇25ml于具塞錐形瓶中，精密稱重，超聲提取45min，稱重，以50%甲醇補足失重，過濾，取續濾液過0.45μL微孔濾膜，即得。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1μL，3μL，5μL，7μL，10μL分別進樣，按上述色譜條件測定，以峰面積對進樣量進行回歸分析。綠原酸的回歸方程為Y=2.9599X-4.2246，r=0.9998；芒果苷的回歸方程為Y=1.1964X-2.6344，r=0.9996。結果表明呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 取同一批供試品溶液，分別按上述色譜條件連續進樣5次，測得綠原酸峰面積RSD = 3.04%，芒果苷峰面積RSD = 2.97%，精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批廬山石韋進行平行實驗6次，約0.5g，精密稱定，測得綠原酸平均含量 = 0.7456mg/g，RSD = 2.89%，芒果苷平均含量 = 0.2189mg/g，RSD = 1.43%。結果表明重現性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取同一批供試品溶液，分別于0h、2h、4h、6h、8h進樣，測定綠原酸和芒果苷峰面積值，結果綠原酸平均含量0.7484mg/g，RSD = 0.76%；芒果苷平均含量0.2208mg/g，RSD =1.85%。結果表明穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取同一批廬山石韋6份，約0.25g，精密稱定，加入一定量的綠原酸和芒果苷對照品，按上述色譜條件測定，計算回收率。結果如表1和表2所示，回收率良好。

表1 綠原酸加樣回收實驗結果

表2 芒果苷加樣回收實驗結果

2.2 超聲提取工藝考察

2.2.1 乙醇濃度的考察 精密稱取0.5000 g廬山石韋粉末，置于50mL三角瓶中，按料液比為1:20 (g/mL)依次加入20、40、60、80、90%濃度的乙醇，在60W功率下超聲30 min。以HPLC法測定綠原酸、芒果苷的得率。結果，綠原酸和芒果苷的得率在乙醇濃度40%到80%之間隨濃度的升高而先增加后減少，在60%時達到峰值。

2.2.2 超聲時間的考察：精密稱取0.5000 g廬山石韋粉末，置于50mL三角瓶中，按料液比為1:20 (g/mL) 加入60%濃度的乙醇，60 W功率下分別超聲10、20、30、40、50 min。以HPLC法測定綠原酸、芒果苷的得率。結果，芒果苷的得率一直持上升趨勢，而當超聲時間為30 min時，綠原酸的得率到達峰值。

2.2.3 料液比的考察 取0.5000g廬山石韋粉末，置于50mL三角瓶中，分別按料液比為1:5、1:10、1:20、1:30、1:40(g/mL)依次加入60%濃度的乙醇，60W功率下超聲30min。以HPLC法測定綠原酸、芒果苷的得率。結果，當料液比為1:20逐步增大時，綠原酸和芒果苷的得率也不停增加。

2.2.4 超聲功率的考察 精密稱取0.5000g廬山石韋粉末，置于50mL三角瓶中，按料液比為1:20 (g/mL)加入60%濃度的乙醇，分別選取40、60、80、100 W功率下超聲30 min。以HPLC法測定綠原酸、芒果苷的得率。結果，綠原酸在超聲功率60W時得率最大，同時超聲功率越大，芒果苷的得率越低。

2.2.5 正交試驗 在單因素實驗的基礎上，設計L9(34)正交實驗如表3～4所示，結果見表5～6。

直觀分析結果表明，各因素對綠原酸得率的影響順序為A>B>D>C，即乙醇濃度>超聲時間>固液比>超聲功率；影響芒果苷超聲提取得率的順序為A>D>B=C，即醇濃度>固液比>超聲時間=超聲功率。方差分析結果表明，各因素對廬山石韋中有效成分綠原酸和芒果苷的影響無顯著性差異(P>0.05)。綠原酸最優水平組合為A3B2C1D2，芒果苷最優水平組合為A3B1C1D3或A3B1C2D3。即廬山石韋中綠原酸最優方案為：乙醇濃度為80%，超聲時間為30min，超聲功率為40W，固液比為1:30 g/mL；芒果苷最優提取方案為：乙醇濃度為80%，超聲時間為20min，超聲功率為40或80W，固液比為1:40 g/mL。

表3 因素水平表

表4 正交試驗表

表5 綠原酸方差分析表

表6 芒果苷方差分析表

3 討論

如今并沒有科研人員對超聲提取廬山石韋中綠原酸和芒果苷有效成分進行科學系統實驗研究，本實驗利用超聲提取法快速高效從植物中提取綠原酸和芒果苷。

本實驗對廬山石韋中綠原酸和芒果苷的超聲提取方法進行了研究和優化，所建立的超聲提取方法具有操作簡便、結果準確、快速等優點，適用于該植物含量測定的高效快速提取。實驗利用指標性成分的提取率，考察了不同乙醇濃度，超聲時間，料液比及超聲功率對綠原酸和芒果苷得率的影響，摸索出一套合理高效的超聲提取方法，即廬山石韋中綠原酸最優方案為：乙醇濃度為80%，超聲時間為30min，超聲功率為40W，固液比為1:30 g/mL；芒果苷最優提取方案為：乙醇濃度為80%，超聲時間為20min，超聲功率為40或80W，固液比為1:40 g/mL。

貴州廬山石韋資源較多，提取其有效部位或有效成分可用于臨床醫療、食品添加以及美容保健等。一套科學高效的提取方案對其制藥和開發具有重大的意義。