單因素結合響應面法優化蒙香青蘭總酚含量測定方法

侯 悅 石金剛 李 德 張麗萍 王占黎 靳 敏

(包頭醫學院，內蒙古 包頭 014040)

香青蘭(Dracocephalum MoldavicaL.)為蒙古族習用藥材，青蘭屬唇形科一年生草本植物，在內蒙古、甘肅、青海及新疆等省份均有分布[1]。因其較高藥用價值，蒙香青蘭在蒙醫臨床中應用廣泛。現代研究表明，該藥材具有緩解心絞痛癥狀,抑制心肌缺血再灌注損傷,抗脂質過氧化損傷等作用[2]。香青蘭全草中含有酚類、黃酮類、萜類和微量元素等物質[3]。其中酚類物質具有抗氧化、強化血管壁、促進腸胃消化、降低血脂肪等作用，這與蒙香青蘭的藥理作用密切相關[4]。本文對蒙香青蘭中總酚含量的測定方法進行了探討，為進一步研究蒙香青蘭中酚類物質奠定基礎。

植物中總酚含量的測定方法主要為福林酚比色法[5]。文獻查閱得出，不同植物的福林酚比色法檢測條件存在較大差異[6]。因此，本實驗通過單因素結合Box-Behnken響應面法，以吸光度為指標，對福林酚比色法測定蒙香青蘭總酚含量的方法進行優化，最后通過方法學實驗評價其準確性及合理性[7-8]。

1 材料與儀器

1.1 儀器與設備 UVmini-1240紫外可見分光光度計(SHIMADZU)，T6新悅-可見分光光度計(普析通用)，DFX-4C200克密封型搖擺式粉碎機(廣州市大祥電子機械設備有限公司)，JB-60D數顯恒速攪拌機(上海精密儀器儀表有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海科恒實驗發展有限公司)，SHZ-Ⅲ循環水真空泵(上海知信實驗儀器技術有限公司)，RE-2000ARE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，TYXH-I漩渦混合器(姜堰市天儀電子儀器有限公司)，天馬FA2004電子天平，雙嘉冷凍干燥機，BSV10油旋片式真空泵(寧波鮑斯能源裝備股份有限公司)

1.2 材料與試劑 蒙香青蘭全草2015年8月購買于內蒙古通遼市，全草用電動粉碎機制成粉末，裝于塑料袋，放置于干燥陰暗處備用。

福林酚試劑(SIGMA公司)，DMSO(SIGMA公司)，沒食子酸標準品(國藥集團化學試劑有限公司，批號為20150409)，碳酸鈉，乙醇，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯等試劑均為國產分析純，去離子水。

2 實驗方法

2.1 蒙香青蘭總酚提取物的制備 取適量干燥的蒙香青蘭植物粉末，用40%乙醇，于65℃下提取兩小時，過濾得總酚提取液，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯進行萃取，得乙酸乙酯提取物，旋干并凍干，得到干燥的蒙香青蘭總酚提取物粉末備用。

2.2 初定反應體系 預實驗中蒙香青蘭總酚的反應體系暫定為：取2.1中的蒙香青蘭總酚提取物溶于DMSO，配成2.0mg/mL的蒙香青蘭總酚試液。后取0.05mL試液于10mL比色管中，加入3.95mL去離子水漩渦混勻后，再加入0.25mL福林酚試劑，漩渦混勻并避光靜置5min。之后加入20%碳酸鈉0.8mL，漩渦混勻后加去離子水定容至10mL，搖勻，室溫下避光反應150min，在一定波長下測吸光度[9]。

2.3 最大吸收波長的確定 取適量蒙香青蘭總酚試液及沒食子酸標準溶液，參照2.2顯色反應，在500～800nm進行全波段掃描，以確定最大吸收波長。

2.4 影響蒙香青蘭總酚含量測定的單因素考察 分別以福林酚試劑的體積(mL)、20%碳酸鈉溶液的體積(mL)、水浴溫度(℃)、水浴時間(min)為單一自變量，固定其他變量，以吸光度為因變量，對單因素進行考察分析。

2.5 響應面優化實驗 在2.4實驗結果的基礎上，響應面優化實驗的考察因素確定為：福林酚試劑體積(A)、20%碳酸鈉溶液的體積(B)、水浴溫度(C)，根據Box-Behnken中心組合設計原理，分別以各因素在單因素實驗中得到的最佳值為中心，圍繞最佳值上下各取1個水平作為響應面的水平，以吸光度為考察指標，具體見表1。

2.6 方法評價實驗 通過重復性、重現性、穩定性及回收率實驗等方法學驗證實驗，考察方法的準確度和穩定性。

表1 Box-Behnken設計因素水平及編碼值

3 結果與討論

3.1 最大吸收波長的確定 參照2.3的實驗設計進行最大吸收波長的測定，結果表明，沒食子酸標準品溶液和蒙香青蘭總酚試液均在760nm波長處有最大吸收，所以選擇檢測波長為760nm。

3.2 單因素實驗結果

3.2.1 水浴時間及溫度對蒙香青蘭總酚含量測定的影響 由圖1(A)可知，25℃、35℃、40℃、45℃下，吸光度隨水浴時間的延長而逐漸增大，無相對穩定時間；50℃、55℃下，從水浴時間30min開始，吸光度呈現相對穩定狀態，且55℃時吸光度高于50℃吸光度。60℃下，吸光度隨水浴時間的延長而逐漸降低，無相對穩定時間。因此，為方便實驗測定及后續實驗，選定水浴溫度為55℃，水浴時間為30min。

3.2.2 福林試劑用量對蒙香青蘭總酚含量測定的影響 由圖1(B)可知，隨著福林試劑體積的增加，吸光度值變化明顯。當福林試劑體積為0.5mL，吸光度達到最大。因此，福林試劑體積選定為0.5mL。

3.2.3 碳酸鈉試劑用量對蒙香青蘭總酚含量測定的影響 由圖1(C)可知，隨著20%碳酸鈉體積的增加，吸光度值呈現先逐漸增加后下降的趨勢，在碳酸鈉體積為0.9mL時，吸光度出現最大值。因此，20%碳酸鈉體積選為0.9mL。

綜上分析，單因素實驗優化結果為：福林酚試劑體積0.5mL，碳酸鈉溶液體積為0.9mL，且水浴時間30min，水浴溫度55℃時，反應體系穩定且靈敏度較好。

3.3 響應面優化實驗

3.3.1 實驗設計及結果 按照2.5實驗設計，本試驗共含有17個試驗，其中12個為析因實驗，5個中心點重復實驗。利用Design-Expert8.0.6軟件對綜合評分結果進行二次多元回歸擬合，得到綜合評分結果對A,B和C的二次多項回歸模型方程為：Y=0.42+6.163*10-3A+0.055*B+4.075*10-3C+0.018AB+0.014AC-8.425*10-3BC-0.026A2-0.071B2-0.010C2。利用Design-Expert8.0.6軟件，進一步對實驗結果進行方差分析。

回歸方程中各變量對指標響應值影響的顯著性，由F檢驗來判斷，概率P值越小，相應的變量顯著程度就越高。由方差分析結果可知，此模型P值<0.01，表明本實驗模型擬合極顯著，可用來響應值預測；失擬項F值為1.07，P=0.4546>0.05，不顯著，說明實測值與預測值之間無失擬存在,實驗誤差小，本實驗無其他顯著性因素的影響，因此模型成立，可以用于指導實驗。由F值大小可推斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對響應值的影響順序為B>A>C，其中B因素(碳酸鈉體積)P<0.01，表明B因素極顯著，具有統計學意義。A、C因素對響應值影響不大。A2、B2項對響應值極顯著(P<0.01)，AB項影響顯著(0.01

3.3.2 二次擬合響應面分析 繪制響應面3D曲面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，可以直觀反映出各因素及其交互作用對響應值的影響，如圖2所示。

從響應曲面圖可以看出，每個曲面都存在最高點。圖中可以看出當福林體積為0.60mL左右，碳酸鈉體積為1.20mL左右溫度在54～58℃范圍內，響應面趨于頂點位置，吸光度的值最高。圖2(A)顯示，吸光度隨福林體積的增加呈現先增后減的趨勢，隨碳酸鈉體積的增加先快速上升后緩慢下降，與方差分析結果相同，且碳酸鈉體積對吸光度的影響較為顯著。圖2(B)顯示，吸光度值隨福林體積的增加呈現先增后減的趨勢，隨溫度的增加有不明顯的先增后減的趨勢，福林體積對吸光度值的影響較為顯著。圖2(C)顯示，吸光度值隨碳酸鈉體積的增加呈現先快速上升后緩慢下降的趨勢，隨溫度的增加先緩慢增加，后逐漸趨于平緩的趨勢，二者交互作用較為顯著，碳酸鈉體積對吸光度的影響較為顯著。由此可知，3個因素對響應值的影響順序為碳酸鈉體積>福林體積>溫度，與方差分析結果顯示相同。

圖2

3.3.3 驗證實驗 根據軟件分析所得的結果，得到蒙香青蘭總酚含量的最優檢測條件為：福林試劑體積為0.62mL，20%碳酸鈉溶液體積1.22mL，水浴溫度55℃，在該條件下，吸光度的預測值為0.4309，該優化檢測條件與響應曲面圖結果吻合。考慮實驗的可行性，對所得結果進行優化和驗證實驗。在福林試劑體積為0.60mL，20%碳酸鈉溶液體積1.20mL，水浴溫度為55℃的條件下，進行5次平行實驗，所測得的吸光度平均值為0.4254，相對標準偏差為0.20%，與預測值的相對誤差為1.28%，說明該模型具有

很好的預測性，且結果穩定可靠。

3.4 測定方法評價

3.4.1 線性關系考察 準確配制不同濃度的沒食子酸溶液及不同濃度的蒙香青蘭提取物溶液，按照上述優化結果分別測量吸光度值，得到線性回歸方程分別為：Y=173.12X-0.1449(R2=0.9978)，Y=0.1001X+0.0912(R2=0.9943)。結果表明沒食子酸及樣品溶液濃度分別在0.2-1.0mg/mL及1.0-3.0mg/mL與吸光度線性關系良好。

3.4.2 重復性考察 按已確定的最適條件，準確量取高(3.0mg/mL)、低(1.0mg/mL)2個濃度，體積為0.05mL的蒙香青蘭總酚試液各1份，由同一分析人員在760nm波長處平行測定5次吸光度，結果得：1.0mg/mL時吸光度平均值為0.1892，SD為0.000245，RSD為0.13%。3.0mg/mL時吸光度平均值為0.6036，SD為0.000316，RSD為0.05%。表明該方法重復性良好。

3.4.3 重現性考察 按已確定的最適條件，準確量取高(3.0mg/mL)、低(1.0mg/mL)2個濃度，體積為0.05mL的蒙香青蘭總酚試液各1份，由不同實驗儀器，不同分析人員在760nm波長處平行測定5次吸光度，結果得：1.0mg/mL時吸光度平均值為0.196，SD為0.000866，RSD為0.44%。3.0mg/mL時吸光度平均值為0.611，SD為0.000707，RSD為0.12%。表明該方法重現性良好。

3.4.4 穩定性考察 按已確定的最適條件，準確量取高(3.0mg/mL)、低(1.0mg/mL)2個濃度，體積為0.05mL的蒙香青蘭總酚試液各1份，從30min開始，每隔10min在760nm波長處測定吸光度，連續測定3次。結果得：1.0mg/mL時吸光度平均值為0.2030，SD為0.006756，RSD為3.33%。3.0mg/mL時吸光度平均值為0.5894，SD為0.002946，RSD為0.50%。表明低濃度樣品在50min內穩定性較差，高濃度樣品在50min內穩定性較好。

3.4.5 加標回收率測定 準確量取5份濃度為1.0mg/mL蒙香青蘭總酚提取液0.05mL，分別加入沒食子酸0.0250mg，按以上實驗確定的最適條件，測定5份樣品的吸光度并計算混合后的總酚含量。計算回收率及相對標準偏差，結果見表2。

由表2可知，測定5份樣品的標準偏差為1.04%，相對標準偏差為1.06%，回收率為97.70%，表明該方法相對可靠，可以用于蒙香青蘭總酚含量的測定。

表2 沒食子酸加樣回收率實驗

4 結論

通過優化實驗和方法評價實驗得出，香青蘭總酚含量的最優檢測條件為：取適量蒙香青蘭總酚提取物，加入3.95mL去離子水漩渦混勻后，再加入0.6mL福林酚試劑，漩渦混勻并避光靜置5min。之后加入20%碳酸鈉1.2mL，漩渦混勻后加去離子水定容至10mL，搖勻，于55℃恒溫水浴箱中避光反應30min，在760nm波長測吸光度。該方法操作較為簡便快捷，設備要求低，重復性及重現性良好，50min內檢測穩定性高，回收率為97.70%，可用于測定蒙香青蘭植物中總酚含量。