離體培養中利用病菌粗毒素檢測香蕉枯萎病抗性研究

羅燕羽，劉紹欽，黃紹力，劉偉光，張木清，黃熾輝

（廣州市農業科學研究院，廣東 廣州 510308）

香蕉（Musa spp.）是我國華南地區四大佳果之一，也是世界著名的熱帶、亞熱帶水果。香蕉枯萎病（Banana Fusarium wilt）又稱香蕉巴拿馬病、黃葉病，是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp.cubense，FOC）侵染而引起維管束壞死的一種毀滅性真菌病害和典型的土傳病害［1-2］。尖孢鐮刀菌以菌絲體、大型分生孢子和小型分生孢子的形式附著于根系表皮細胞，通過分泌一系列毒素破壞根系的膜結構，造成植株代謝紊亂，感染后期可直接侵染植株維管束，導致維管束木質化［3］。該病最早于1874年在澳大利亞被發現，1890年開始在中美洲發生流行，20世紀60年代在我國也開始發生［4］，近幾年，香蕉枯萎病依然在蔓延，且已導致多個主產區的香蕉種植面積迅速下降，嚴重影響了香蕉產業的發展［5］。尖孢鐮刀菌古巴?；凸灿?個生理小種，為害廣東、廣西、福建、海南、云南局部地區的主要為1號生理小種和4號生理小種，其中4號生理小種的危害性最大、分布最廣，其寄主范圍及為害程度均大于其他小種［6］。

目前控制香蕉枯萎病的主要手段還是化學防治、生物防治、輪作與套種及綜合防控。柳紅娟等［7］認為木薯塊根的浸提液對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌有一定抑制效果，可通過木薯與香蕉間套種或木薯與香蕉輪作等栽培模式，起到抑制香蕉病害發生的作用；陳遠鳳等［8］研究發現，使用濃度高于5 mg/L的ClO2進行水體消毒可有效預防枯萎病和軟腐病通過水源傳播，用濃度為1 500 mg/L的ClO2可清除發病蕉穴土壤中的病原；劉衛軍［9］使用生防制劑可顯著降低香蕉枯萎病的發病率和病情指數，且還能增加土壤微生物多樣性指數。雖然化學防治、生物防治、輪作與套種等手段在一定程度上可以控制香蕉枯萎病的蔓延，但是要想從根本上解決問題，培育出抗枯萎病的香蕉品種是最好的防治措施［10-12］。近年來，選育抗（耐）枯萎病的主要手段是在離體條件下，利用化學誘變劑、枯萎病菌培養濾液或毒素等化學或生物誘變來篩選抗病突變體［6］，且其獲得抗病突變體效率高、操作程序簡單，已成為目前快速選育香蕉抗病品種的重要手段。Matsumoto等［13］最先研究發現，在培養基中添加粗毒素篩選出的耐毒素突變體可明顯提高對香蕉枯萎病的抗病性。韋紹龍等［14］利用組織培養芽變和接種病菌壓力選擇的方法也選育出抗（耐）香蕉枯萎病品種——桂蕉9號。據報道，目前抗（耐）枯萎病香蕉品種主要有抗枯5號、農科1號、桂蕉9號、寶島蕉、金手指等，但是關于這些抗病品種的抗性機理還不是很清楚［15］。

雖然關于在離體條件下，利用香蕉枯萎病菌粗毒素來篩選抗病突變體是獲得抗（耐）毒素的報道已有頗多，但是在生產應用上還尚未有通過該方法獲得的抗枯萎病香蕉品種。本研究結合組織培養技術，利用香蕉枯萎病菌粗毒素對巴西蕉、農科1號、粉雜1號、粉蕉和東莞大蕉5個不同枯萎病抗性品種香蕉的離體培養芽進行處理，研究品種抗性與粗毒素的相關關系，以期得出在離體培養早期鑒定品種抗性的可行性；利用香蕉病粗毒素對兩個香蕉品種進行選擇性誘變，以期篩選出抗（耐）枯萎病的新品系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為巴西蕉、農科1號、粉雜1號、粉蕉、東莞大蕉吸芽所誘導的增殖芽第5代，巴西蕉、農科1號薄片培養的不定芽，以上材料均來自廣州市農業科學研究院。

供試菌株為香蕉枯萎病菌——尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種，來自廣州市農業科學研究院。供試藥品鐮刀菌酸（Fusaric acid，FA）購自Sigma公司。PDA培養基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15 g瓊脂粉，去離子水定容至1 000 mL；大米培養基：50 g大米，60 mL混合液（含0.5%土壤浸出液+0.2%ZnSO4溶液），過夜培養浸泡后，過濾，稱取50 g大米于250 mL三角瓶中，加入60 mL稀釋后的濾液（蒸餾水∶濾液=9∶1），密封后121℃滅菌30 min備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗毒素制備 香蕉枯萎病菌粗毒素的制備參考陳石［16］和武玉卓等［17］的方法略有改動。具體操作方法如下：（1）將菌株接種于PDA培養基上生長7 d后，用無菌水制成106個/mL的孢子懸浮液；（2）孢子懸浮液按5%的接種量接種于大米培養基上，充分混勻后，于28℃的恒溫培養箱中培養20 d，期間每天搖動培養基，以使培養基充分疏散，防止菌絲結塊；（3）培養結束后，將培養物85℃滅菌30 min，以殺死菌絲和孢子；（4）將滅菌后的培養物用乙酸乙酯浸泡2 h，過濾出菌絲和培養物，收集乙酸乙酯相，50℃減壓濃縮至干，即得毒素結晶；（5）用少量95%乙醇溶解結晶并用蒸餾水定容至10 mL，即得粗毒素溶液，無菌過濾，-20℃貯存備用。

1.2.2 FA含量測定 以FA為標準，用紫外分光光度計測定不同濃度（5、10、15、20、25 mg/L）下標準FA的紫外吸收圖譜及吸光度（OD269），以光密度為縱坐標、FA濃度為橫坐標繪制FA標準曲線。在相同條件下，將粗毒素液用蒸餾水稀釋至適當濃度，在紫外分光光度計上計算濾液中FA的含量（mg/L），公式如下：

試樣FA含量=試樣OD值×標樣FA含量/標樣OD值

1.2.3 不同品種香蕉對FA的敏感性測定 將所提取的粗毒素加入到香蕉吸芽所誘導的組培苗增殖芽培養基中，配置成FA濃度為15、35、55、75 mg/L的培養基，將香蕉組培苗接入含毒素的培養基，每瓶接7株（芽），每個處理6瓶，3次重復，培養20 d后統計不同品種香蕉組培苗增殖芽的存活率，公式如下：

不同品種香蕉對FA的敏感性以芽的存活率來計算，芽的存活率越高，敏感性越差。

1.2.4 抗性目標芽的離體篩選 （1）香蕉薄片培養。將香蕉的組培苗去掉假莖外部的葉片，從莖段基部第1條根部位起，向上1.5 cm作為切取薄片的部位，從下向上依次切取0.3～0.5 mm厚的薄片接種于香蕉薄片培養基中，香蕉薄片培養基為MS+6-BA 4 mg/L+IAA 0.2 mg/L，培養出不定芽后加代繁殖備用。

（2）半致死FA濃度的測定。半致死FA濃度的測定參考張俊［6］和劉海瑞等［18］的方法進行設定，具體如下：以巴西蕉和農科1號薄片誘導的不定芽為材料，將其接入到含FA濃度為15、35、55、75 mg/L的培養基中，每瓶接7株，每個處理6瓶，3次重復，以不含毒素的培養基為對照組。培養20 d后統計成芽率，初步確定出半致死劑量。

（3）目標芽的篩選。以巴西蕉和農科1號通過薄片培養獲得的不定芽為材料，按如下步驟進行粗毒素壓力篩選：半致死濃度轉接至芽存活趨于穩定——高濃度（半致死濃度加倍）轉接至芽存活趨于穩定——空白——半致死濃度，以不含粗毒素培養為空白對照，每瓶接7株，每個處理6瓶，3次重復，培養20 d后統計組培苗增殖芽的存活率。

1.2.5 數據統計與分析 使用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數據統計，采用Ducan法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 粗毒素中FA含量的測定

根據5種含不同劑量FA標樣溶液在269 nm處所測得的OD值結果，制成FA含量和OD269的標準曲線（圖1），其線性方程為：Y=0.047X-0.038（R2=0.996）。在相同條件下測出粗毒素試樣的OD269，根據標準曲線換算后得出供試樣品的FA含量為325.2 mg/L。

圖1 FA標準曲線

2.2 不同品種香蕉組培增殖芽對FA的敏感性測定

在生產實踐中，已知5個品種香蕉對尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種抗性程度由強至弱表現為東莞大蕉＞粉雜1號＞農科1號＞巴西蕉＞粉蕉［19］。5個品種組培苗增殖芽在含不同劑量粗毒素的培養基中培養后，增殖芽的存活率隨著FA濃度的提高而下降，但不同品種對FA濃度的敏感性存在較大差異（表1、圖2，封二）。由表1可知，5個品種的香蕉離體培養芽對粗毒素的敏感性程度表現為農科1號＞粉蕉＞粉雜＞巴西蕉＞東莞大蕉。比較品種抗性和離體增殖芽敏感性測定發現，品種的抗病性與對粗毒素的敏感性并沒有相關關系，對尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種抗性強的香蕉品種，經粗毒素處理后存活率不一定就高，可見，通過組培苗增殖芽對粗毒素的敏感性測定并不能判斷一個香蕉品種對尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種抗性的強弱。

表1 不同品種香蕉對FA的敏感性測定結果

2.3 巴西蕉和農科1號抗性目標芽的離體篩選

2.3.1 巴西蕉和農科1號FA半致死濃度的測定 在含不同濃度FA的處理下巴西蕉和農科1號薄片誘導不定芽的存活率如表2所示，隨著FA濃度的升高，在同一FA濃度下，巴西蕉不定芽的存活率均高于農科1號，計算得到巴西蕉的半致死濃度為40.63 mg/L、農科1號的半致死濃度為31.82 mg/L。為方便后續實驗的進行，將35 mg/L設定為后續抗性芽篩選的半致死濃度。

表2 巴西蕉和農科1號FA半致死濃度測定結果

2.3.2 巴西蕉和農科1號抗性目標芽的篩選根據2.3.1的試驗結果，我們以35 mg/L的鐮刀菌酸濃度作為半致死濃度對巴西蕉和農科1號薄片誘導的不定芽進行連續篩選。在前3次篩選過程中，不定芽長勢和存活率均隨著繼代代數的增加而減弱，但從第4次以后則趨于穩定。在芽的存活率穩定后，取健康單芽在不加粗毒素的增殖培養基中增殖1代，再在高劑量粗毒素培養基中進一步誘變篩選；當芽的存活率進一步穩定后，選取健康單芽接入不加粗毒素的增殖培養基中繼代培養1次，然后再接回半致死濃度粗毒素的增殖培養基中，重復上面過程，直到最后半致死濃度培養的芽存活率比第1次半致死濃度培養的芽存活率顯著提高并得以穩定（表3）。說明經粗毒素多次誘變后，兩個品種香蕉的耐毒素能力得以提高并穩定遺傳，最后篩選出最健壯的兩個芽為抗（耐）病目標材料，田間抗性有待進一步進行苗期接種試驗和大田小區試驗。

表3 巴西蕉和農科1號FA抗性目標芽的篩選結果

3 結論與討論

關于在離體條件下，用香蕉枯萎病菌粗毒素作為壓力來篩選抗（耐）病性突變體的研究報道較多，研究發現香蕉枯萎病菌毒素是一類非專化性毒素，對不同抗性的香蕉品種均具有明顯的致病作用，但不同香蕉品種對毒素的敏感性程度與田間真實的抗病性之間的關系卻存在差異。本試驗結果表明，香蕉離體培養芽對粗毒素的敏感性程度與香蕉品種的抗病性無相關關系，這與 Matsumoto［13］和李梅婷［20］的結果相一致，而與楊秀娟等［21］和Companioni等［22］的研究結果相反。然而，甘林等［23］研究表明，香蕉組培生根苗的耐毒素能力與品種抗病性有一定的相關性。國內外雖對尖孢鐮刀粗毒素的誘導、產毒條件及其生物活性雖已有較多研究［24］，但對枯萎病粗毒素的組成成分和致病機制研究較少，對于導致香蕉枯萎病產生的主要致病因子還要進行更深入的研究。可見，在離體培養增殖階段鑒定品種對枯萎病的抗性是不確切的，耐毒突變體的抗性機制也還需要作進一步研究。

薄片培養具有細胞少、面積大、培養過程中可充分接觸培養基等優點，通過薄片培養誘導出來的不定芽可以減少嵌合體的出現［25-27］，本研究利用薄片培養誘導出來的不定芽，進行連續粗毒素篩選抗性不定芽以減少嵌合體的發生，對保證突變體的穩定性具有良好效果。大多數研究者認為，篩選時采用半致死水平的濃度較為合理［28］。本研究在對不定芽經過粗毒素半致死濃度多次篩選和高濃度篩選后，獲得了耐毒素芽，但對枯萎病的抗病性還需要通過苗期接種和田間小區抗病性試驗進一步檢驗。