枯草芽孢桿菌TR21可濕性粉劑對(duì)香蕉根際土壤微生物的影響

樊勝南，喻國(guó)輝，陳燕紅，黎永堅(jiān)，陳川雁

（珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，廣東 珠海 519075）

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp.cubense）引起的毀滅性病害，是一種典型的土傳病害，病菌蔓延快，防治難度大。生產(chǎn)上常見的措施包括抗病品種選育、化學(xué)防治、生物防治和輪作等，生物防治具有環(huán)境污染小、安全程度相對(duì)較高并具有綜合調(diào)控等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到青睞［1］，可用于香蕉枯萎病防治的生防菌包括木霉（Trichoderma spp.）、假單胞菌（Pseudomonas spp.）、芽胞桿菌（Bacillus spp.）和放線菌（Actinomycetes）等［2］。近年來(lái)的研究顯示香蕉根際微生物群落與枯萎病的發(fā)生關(guān)系密切。土壤病原菌濃度越高香蕉越容易發(fā)生枯萎?。?］，發(fā)病級(jí)別越重的土壤病原菌數(shù)量也越高［4］。病原菌的存在還能夠顯著提高真菌數(shù)量及其比例，顯著降低放線菌及其比例［5］，發(fā)病嚴(yán)重的植株根際細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著減少，真菌數(shù)量顯著增加［6］。利用芽胞桿菌制備的有機(jī)肥能夠防治粉蕉的病害［7］，防治效果與土壤微生物群落發(fā)生改變有關(guān)，其中功能細(xì)菌在防治效果中具有重要作用［8］?？莶菅堪麠U菌R31施用后能夠增加中粉1號(hào)粉蕉根際細(xì)菌的總量，減少根際真菌、放線菌和鐮刀菌的總量［9］。

枯草芽胞桿菌TR21是一株分離自石斛蘭葉片的植物內(nèi)生細(xì)菌［10］，對(duì)多種植物病原真菌和細(xì)菌具有廣譜拮抗活性，能夠在香蕉體內(nèi)定殖［11］并引起香蕉抗病酶［12］和相關(guān)基因［13］表達(dá)的升高，在大田試驗(yàn)中對(duì)香蕉枯萎病表現(xiàn)出一定的防效［14-16］。為了了解田間施用TR21對(duì)香蕉根際土壤微生物的影響，我們采集了施用TR21可濕性粉劑灌根處理前后不同時(shí)期的香蕉根際土壤，采用DGGE方法對(duì)根際土壤微生物多樣性進(jìn)行分析，以期為揭示該菌的防效機(jī)制和指導(dǎo)田間應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品 試驗(yàn)共采集10個(gè)土壤樣品。土壤樣品于2015年采集自珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心試驗(yàn)田，每個(gè)標(biāo)樣按照常規(guī)5點(diǎn)取樣后混合作為1個(gè)標(biāo)樣。將土壤裝入無(wú)菌塑料袋內(nèi)封口，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃下保存?zhèn)溆?。土樣樣品信息如下：土?1：對(duì)照區(qū)香蕉種植前土壤；土樣52：生防菌處理區(qū)香蕉種植前土壤；土樣71：對(duì)照區(qū)香蕉生長(zhǎng)初期土壤；土樣72：生防菌處理區(qū)香蕉生長(zhǎng)初期土壤；土樣101：對(duì)照區(qū)香蕉生長(zhǎng)中期土壤；土樣102：生防菌處理區(qū)香蕉生長(zhǎng)中期土壤；土樣b20：生防菌處理區(qū)發(fā)病植株根際土壤；土樣b24：對(duì)照區(qū)發(fā)病植株根際土壤；土樣j20：生防菌處理區(qū)健康植株根際土壤；土樣j24：對(duì)照區(qū)健康植株根際土壤。

1.1.2 供試菌株 大腸桿菌（Escherichia coli DH5α）和枯草芽孢桿菌TR21可濕性粉劑由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 酶及主要試劑 過(guò)硫酸銨、EDTA、去離子甲酰胺、瓊脂糖M、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、丙烯酰胺等試劑購(gòu)自上海生工生物公司；DNA純化試劑盒Wizard DNA Clean-up System購(gòu)自Promega公司；土壤細(xì)菌DNA提取試劑盒Soil DNA Kit（50）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit和質(zhì)粒抽提試劑盒Plasmid Mini Kit I（50）購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司；pMD19-T載體、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、Premix Ex Taq Version 2.0等購(gòu)自TAKARA公司；硝酸銀、氯仿等購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。引物合成與測(cè)序由Invitrogen公司完成。土壤抽提緩沖液含100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA-Na2、1.5 mol/L NaCl、1%CTAB、100 mmol/L Na3PO4，pH 8.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤總DNA提取 稱取0.5 g土樣到滅菌50 mL離心管中，加入13.5 mL土壤抽提緩沖液和10 μL蛋白酶K，37℃、225 r/min搖床30 min。加入1.5 mL 20% SDS，65℃水浴2 h（每隔15～20 min搖勻1次），6 000 r/min離心10 min，上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)50 mL滅菌離心管中，原離心管中再加入4.5 mL土壤抽提緩沖液和0.5 mL 20%SDS。用玻璃棒攪勻，漩渦混勻器混勻10 s，65℃水浴10 min，6000×g離心10 min，合并上清。加等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）抽提1次，6000×g離心5 min，取上清于另一滅菌離心管中。再加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1）抽提1次，6 000 r/min離心5 min后取上清于另一滅菌離心管中。在上清中加入0.1倍體積的3 mol/L NaAc（pH 5.2）混勻，加入0.6倍體積異丙醇室溫沉淀DNA 1 h。室溫16 000 r/min離心20 min，棄上清。DNA沉淀用70%乙醇洗滌1次，自然風(fēng)干后將DNA沉淀溶于600 μL滅菌的TE緩沖液中，-20℃保存。

1.2.2 巢式PCR 參照歐陽(yáng)嫻等［17］的方法，第1次PCR：所用引物為細(xì)菌通用引物F27（5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’）和 V3 高變區(qū) R518（5’ATTACCGCGGCTGCTGG 3’）。第2次PCR：以第1次PCR產(chǎn)物為模板，引 物 為 F338GC（5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG ACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3’）和 R518。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 采用濃度為8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度46%～54%，PCR純化產(chǎn)物上樣量400 ng，凝膠于60℃，80 V電泳12 h，銀染，拍照。

1.2.4 DGGE電泳圖譜分析 參照歐陽(yáng)嫻等［17］的方法，使用Quantity one V4.6軟件對(duì)DGGE電泳圖譜進(jìn)行分析，再用Sorenson配對(duì)比較相似性系數(shù)Cs比較相似性。

1.2.5 DGGE主條帶回收與基因克隆測(cè)序 將清晰可見的條帶切下，用滅菌的去離子水清洗后，加入30 μL滅菌去離子水并將膠帶搗碎，60℃溫浴1 h，4℃靜置16 h，3 000 r/min離心收集上清液。取1 μL上清液，用F338和R518引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序同第2次PCR。PCR產(chǎn)物一部分用于再次DGGE電泳，驗(yàn)證條帶是否是原來(lái)的條帶，另一部分用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠條帶用E.Z.N.A Gel Extraction Kit回收。然后取4.5 μL回收產(chǎn)物連接至p MD19-T載體，轉(zhuǎn)入100 μL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，然后加入800 μL LB液體培養(yǎng)基37℃復(fù)蘇培養(yǎng)1 h，5 000 r/min離心1 min后，去掉800 μL上清液，加入20 μg/mL的X-gal 40 μL和200 μg/mL的IPTG 7 μL混勻，然后均勻涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。用滅菌的牙簽隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆子于5 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體中，37℃、180 r/min振動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜（14～16 h），12 000 r/min離心1 min收集菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用HindII和EcoRI進(jìn)行雙酶切鑒定無(wú)誤后，送往Invitrogen公司（上海）測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品的變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析

對(duì)10個(gè)土壤樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，10個(gè)土壤樣品都分離到若干條帶，且?guī)陀兴煌?。在香蕉種植晚期的發(fā)病植株根際樣品中，對(duì)照區(qū)（b24）條帶比處理區(qū)（b20）少、且明亮條帶多，與處理區(qū)健康植株根際樣本j24相比，部分條帶變?nèi)趸蛳?，顯示發(fā)病后有部分條帶消失。j20樣品經(jīng)芽胞桿菌TR21處理，其土壤微生物的多樣性比j24有非常明顯的提高，說(shuō)明用芽胞桿菌TR21可濕性粉劑灌根可以提高土壤的微生物多樣性。

圖1 10個(gè)土壤樣品16S rDNA V3 片段DGGE分析結(jié)果

2.2 DGGE圖譜的物種豐度和微生物多樣性指數(shù)分析

利用Quantity one軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行識(shí)別條帶的分析，得到圖譜的物種豐度S值和生物多樣性指數(shù)H值，如圖2所示。圖2顯示，運(yùn)用芽胞桿菌TR21處理可以提高土壤的生物多樣性，隨著時(shí)間的推移，處理區(qū)和對(duì)照區(qū)香蕉根際微生物的豐富度均逐漸升高，而多樣性則逐漸減小。種植前，對(duì)照區(qū)的土樣（51）生物多樣性和豐富度高于處理區(qū)（52）。使用枯草芽胞桿菌TR21處理后，無(wú)論是在香蕉生長(zhǎng)初期（71和72）還是中期（101和102），處理區(qū)（72和102）的生物多樣性和物種豐富度均高于對(duì)照（71和101）。但在香蕉種植后期，施用過(guò)生防菌的發(fā)病植株根際土壤樣品（b20），檢測(cè)出來(lái)物種豐度（S）比對(duì)照（b24）高，但生物多樣性（H）比對(duì)照低，健康植株根際土樣（b20與b24）的物質(zhì)豐富度和生物多樣性與發(fā)病植株的特征一致?？梢?，生防菌處理后引起物種豐富度增加，但生物多樣性降低。

圖2 10個(gè)土壤樣品物種豐度和微生物多樣性分析

利用Quantity one軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行識(shí)別條帶的分析得到DGGE的UPGMA聚類分析結(jié)果見圖3。微生物種群多樣性聚類分析顯示j24和j20兩個(gè)土樣的微生物相似最高，達(dá)到68%，即香蕉種植后期用TR21處理過(guò)的健康植株根際土壤微生物與未使用TR21處理的健康植株根際土壤微生物相似性較高。此外，生防菌處理的發(fā)病土壤b20的微生物多樣性接近未發(fā)病的健康土壤j24，相似性達(dá)到60%，而對(duì)照區(qū)的發(fā)病土壤樣品b24與健康組土壤的相似度只有52%，說(shuō)明枯草芽胞桿菌TR21處理對(duì)香蕉根際土壤的微生物生態(tài)改變較大，可以提高生物多樣性，具有穩(wěn)定土壤生物多樣性的能力。

圖3 10個(gè)土壤樣品的16SrDNA V3片段DGGE條帶的微生物種群多樣性的聚類分析

2.3 發(fā)病土壤DGGE圖譜主條帶回收及序列比對(duì)

對(duì)DGGE圖譜上的差異條帶進(jìn)行回收和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast比對(duì)分析，結(jié)果見圖4和表2。從表2可以看出，有9個(gè)條帶與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的非培養(yǎng)細(xì)菌克隆子相似，目前尚無(wú)菌屬信息。其中條帶9為生防菌處理區(qū)特有的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示其為芽胞桿菌。

圖4 回收條帶示意圖

3 結(jié)論與討論

本研究利用PCR-DGGE法對(duì)香蕉種植不同時(shí)期TR21灌根處理與對(duì)照的香蕉植株根際土壤進(jìn)行微生物多樣性分析，發(fā)現(xiàn)隨著種植時(shí)間的推移，處理和對(duì)照的根際土壤微生物豐度S值都逐漸升高，多樣性指數(shù)H值卻逐漸降低，說(shuō)明隨著香蕉種植時(shí)間的延長(zhǎng)，根際微生物中少數(shù)物種的數(shù)量越來(lái)越突出，這與鄧建波等的研究一致，這些微生物的變化這可能與香蕉根系分泌物對(duì)根際微生物產(chǎn)生的選擇性有關(guān)［18］。發(fā)病香蕉根際土壤的物種豐富度S值小于健康香蕉根際土壤的S值，這與鄧曉等［4，18］的研究結(jié)果一致；然而，用TR21處理過(guò)的根際土壤的物種豐度S值一直都大于對(duì)照，而生物多樣性指數(shù)H值卻比對(duì)照小，且經(jīng)TR21處理的根際土壤芽孢桿菌增多，說(shuō)明TR21的施用對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生了影響，在增加物種豐富度的同時(shí)，選擇性增加了某些類群的數(shù)量，降低了群落的均勻度，從而導(dǎo)致S值增大、H值減小。

表2 DGGE圖譜差異條帶的核苷酸序列的比對(duì)結(jié)果

枯草芽胞桿菌TR21施用對(duì)香蕉枯萎病產(chǎn)生的防效可能與其對(duì)香蕉根際芽胞桿菌種群產(chǎn)生的影響有關(guān)。芽胞桿菌是香蕉根區(qū)土壤細(xì)菌的第一優(yōu)勢(shì)種群［19］，數(shù)量和比重的變化與香蕉枯萎病的發(fā)生關(guān)系密切。相關(guān)研究顯示，芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽Surfactin可以作為信號(hào)分子影響自身或其他芽胞桿菌的生物被膜形成［20］，而生物被膜形成過(guò)程中產(chǎn)生的同類相殘機(jī)制也會(huì)進(jìn)一步影響到芽胞桿菌的種群分化和生物被膜形成［21］，這兩種影響生物被膜形成的方式是根際芽胞桿菌種間互作［22］和親緣辨識(shí)的基礎(chǔ)［23］，也是解釋芽胞桿菌施用能夠調(diào)控和影響土壤芽胞桿菌的理論基礎(chǔ)。例如，與TR21一同分離自石斛蘭葉片的枯草芽胞桿菌R31，在田間也能夠防治香蕉枯萎?。?4-15］，對(duì)香蕉根際可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，R31灌根能夠顯著增加根際芽胞桿菌含量［9］，健康植株根際分離的優(yōu)勢(shì)種芽胞桿菌可以與R31相互識(shí)別并影響群游和生物被膜的形成［24］。本研究則通過(guò)PCRDGGE的方式進(jìn)一步證實(shí)這種調(diào)控和影響的確存在，這將為進(jìn)一步利用芽胞桿菌作為生防因子控制香蕉枯萎病提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。