十字花科根腫病菌在水中存活能力檢測(cè)分析

袁 遠(yuǎn) ，曹 喆 ，杜 飛，何鵬飛，何月秋 ，吳毅歆

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

由蕓薹根腫病菌（Plasmoliophora brassicae Woronin）侵染所致的十字花科蔬菜根腫病是十字花科蔬菜的世界性病害之一。該病害導(dǎo)致十字花科蔬菜產(chǎn)量下降，甚至絕收，是一種常見且危害嚴(yán)重的真菌病害［1-5］。該病在我國境內(nèi)十字花科作物上均有發(fā)生，發(fā)病面積約67萬hm2，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)嚴(yán)重影響我國十字花科作物生產(chǎn)。該病的病原菌是一種土傳性活體寄生菌，專性寄生于十字花科植物，不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，病菌從休眠孢子囊萌發(fā)產(chǎn)生游動(dòng)孢子侵入根部，經(jīng)10 d左右致根系形成腫瘤，游動(dòng)孢子是該病傳播的主要危害［7］。根腫病的發(fā)生受溫度、濕度、土壤pH、光照、土壤含水量和病原菌數(shù)量的影響，帶菌水傳播也是根腫病迅速傳播的主要原因之一［8］。對(duì)根腫菌生活史的研究國外比國內(nèi)早，基本上大部分實(shí)驗(yàn)室都是在明確生活史的前提下通過雙重培養(yǎng)技術(shù)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來研究十字花科植物根腫病的發(fā)病全過程。在我國這方面的報(bào)告還很少，處于啟蒙階段［9］。國內(nèi)外對(duì)根腫病的研究一直都很重視，通過不懈的努力在致病機(jī)理、病原菌生理小種鑒定、根腫菌防治、病原體離體技術(shù)等方面均取得了突破性進(jìn)展［9-18］。目前對(duì)于休眠孢子的萌發(fā)環(huán)境及侵染能力之間互作關(guān)系的研究還不是太多。為了更好地防治根腫病的發(fā)生，對(duì)影響根腫病休眠孢子萌發(fā)的生物及非生物因子的研究十分必要［19-20］。本研究通過對(duì)不同溫度水體根腫菌存活情況和水中微生物活動(dòng)及各項(xiàng)水體指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，為研究根腫病休眠孢子萌發(fā)的生物及非生物因子和環(huán)境及侵染能力之間的互作關(guān)系提供依據(jù)，為根腫病的田間防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試根腫病菌于2017年1月采自昆明市周邊白菜種植大棚的病變白菜根腫組織。

1.2 根腫菌孢子檢測(cè)方法

水體根腫菌孢子檢測(cè)方法采用趙瑋琦等［10］方法稍作修改檢測(cè)，并建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 根腫菌的定量檢測(cè)

使用0.22 μm濾膜抽濾樣本水體富集水體微生物，抽濾20～150 mL水體樣本，直至濾膜堵塞難以抽濾，記錄所抽濾水體體積。將濾膜剪碎分裝入2 mL離心管中，依據(jù)DNA Water Kit（OMEGA公司）的說明書提取DNA，用于熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DNA濃度，帶入所抽濾水體體積，計(jì)算原水體根腫菌孢子濃度。

1.4 孢子懸浮液制備

取100 g白菜根腫組織與200 mL純凈水打碎成勻漿狀，四層紗布過濾分裝入50 mL離心管中，2 500 g/min 離心20 min，棄上清液，沉淀重懸于50 mL純凈水中，該步驟重復(fù)3～4次；加入5 mL 50%蔗糖溶液懸浮，2 500 g/min離心20 min；將上清液移入一新的離心管中加入45 mL純凈水，2 500 g/min離心20min，棄上清；沉淀溶于5 mL純凈水中，保存于4℃冰箱中。

1.5 不同水體溫度根腫菌存活檢測(cè)

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)溫度梯度16、19、22、25℃，將4個(gè)光照培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)至上述4個(gè)溫度，每個(gè)溫度下放置3個(gè)模擬水體樣品作為3個(gè)重復(fù)，另設(shè)一個(gè)2 L不含孢子的無菌蒸餾水樣品作為空白對(duì)照。

使用血球計(jì)數(shù)板于顯微鏡下計(jì)算孢子懸浮液中孢子濃度。制備12個(gè)模擬水體樣品，每個(gè)樣品在一個(gè)塑料桶中加入1 990 mL純凈水，加入10 mL稀釋后的孢子懸浮液，將樣品的孢子濃度調(diào)節(jié)至1×106CFU/mL。使用0.1 mol/L HCl溶液將樣品pH值調(diào)節(jié)至5.5；使用電導(dǎo)率儀檢測(cè)測(cè)水體電導(dǎo)率，0.1 mol/L NaCl溶液將樣品鹽度調(diào)到統(tǒng)一值。定期提取各個(gè)樣品的DNA用于熒光定量PCR檢測(cè)計(jì)算樣品水體，同時(shí)測(cè)量各處理的化學(xué)需氧量（COD）和溶解氧含量（DO）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水體溫度下的根腫菌孢子濃度

將模板 DNA 稀釋為 1×107、1×106、1x105、1×104、1×103、1×102、1×101拷貝 /μL 7 個(gè)不同梯度用于進(jìn)行熒光定量PCR。以模板DNA起始濃度的對(duì)數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)，以Ct值（y）為縱坐標(biāo)作熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.101x+34.594，擴(kuò)增效率97%，R2=0.9995。從圖2擴(kuò)增曲線上可發(fā)現(xiàn)該對(duì)引物的精確度為10拷貝/μL，陰性對(duì)照信號(hào)出現(xiàn)在30～35個(gè)Ct值范圍內(nèi)，超過30個(gè)Ct的信號(hào)默認(rèn)為是陰性信號(hào)，該信號(hào)由引物二聚體所產(chǎn)生。根據(jù)所得的熔解曲線（圖 3）可知，在熔解溫度 Tm=84.5℃出現(xiàn)單一峰形，未見其他峰值，說明擴(kuò)增效率和熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠。

圖1 根腫菌質(zhì)粒DNA梯度稀釋后繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同濃度梯度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

圖3 不同濃度梯度質(zhì)粒溶解曲線

2.2 不同水體溫度對(duì)根腫菌存活的影響

在4個(gè)水體溫度梯度16、19、22、25℃，分別接種濃度為3×106CFU/mL根腫菌孢子。水溫在16～25℃區(qū)間內(nèi)，隨著溫度的提高，根腫菌孢子下降的速率變緩，在25℃時(shí)最為緩慢，處理30 d達(dá)1.88×106CFU/mL，并在處理60 d后相對(duì)穩(wěn)定，說明根腫菌在25℃下較其他溫度更容易存活（表1）。

表1 不同時(shí)期各處理孢子濃度

電導(dǎo)率與溶液中離子的含量成比例關(guān)系，可間接判斷水中溶解物質(zhì)的含量。從表2可見，隨時(shí)間的延長，各處理電導(dǎo)率都呈緩慢增大。說明處理中根腫菌呈增長趨勢(shì)。

表2 不同處理水體電導(dǎo)率變化情況（103μS/cm）

溶氧量是衡量生物在水中生存的重要指標(biāo)。氧在水中的含量因有機(jī)物分解及生物呼吸把氧消耗掉而使水中溶氧量經(jīng)常會(huì)改變。從表3可見，不同時(shí)期各溫度處理的溶氧量隨處理時(shí)間增長出現(xiàn)不規(guī)律的浮動(dòng)，說明微生物活動(dòng)頻繁。

表3 不同處理水體溶氧量變化情況（mg/L）

COD作為衡量水中有機(jī)物質(zhì)含量的指標(biāo)，化學(xué)需氧量越大，說明水體中有機(jī)物的數(shù)量多。從表4可見，不同時(shí)期各處理的COD隨時(shí)間增長呈現(xiàn)普遍上升的趨勢(shì)，且不具有規(guī)律性。COD值越高說明水中根腫菌的數(shù)量越多。

表4 不同處理水體化學(xué)需氧量變化情況（mg/L）

3 結(jié)論與討論

根腫病的發(fā)生受溫度、濕度、土壤的pH值、光照、土壤含水量和土壤中病原菌數(shù)量的影響。根腫病發(fā)生的最主要條件是土壤中大量存在的根腫菌休眠孢子［21］。根腫菌休眠孢子可以通過很多途徑進(jìn)行傳播。帶菌水傳播也是根腫病迅速傳播的主要原因之一［8］。在根腫病發(fā)生區(qū)，不僅地塊之間灌溉水漫灌和串灌現(xiàn)象普遍，而且種植戶常在公共水源中清洗蔬菜，隨意丟棄病株或?qū)Р〉氖卟速u給養(yǎng)魚戶喂魚，再用這些被污染了的池塘、水庫中的水灌溉農(nóng)田，從而加速了病菌擴(kuò)散與蔓延，使病害發(fā)生面積逐年擴(kuò)大。根腫病菌傳播，且孢子量越多，感病率越高。研究作物根腫病的傳播途徑，對(duì)規(guī)模化育苗和灌溉水處理控制病害有重要意義。灌溉水?dāng)y帶病原傳播植物病害是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的重要原因，水池育苗能加快病害的蔓延速度，尤其在可利用水較少、降雨量偏少、水分有限時(shí)，這種狀況更為嚴(yán)重。灌溉水中含有根腫菌曾有報(bào)道［8，12］，但已有的研究并未能詳細(xì)闡述灌溉水中所含根腫菌的數(shù)量與其致病性和病害傳播流行之間的關(guān)系［17-18］。

本研究利用實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)首創(chuàng)的水體中根腫菌孢子熒光定量 PCR 檢測(cè)體系［10］，建立QPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測(cè)根腫菌的孢子數(shù)量，對(duì)不同溫度水體根腫菌存活的情況進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在16～25℃區(qū)間內(nèi)，隨著溫度的提高，根腫菌孢子下降的速率變緩，在25℃時(shí)相對(duì)最為緩慢，這與過去的研究中認(rèn)為根腫菌最適宜的發(fā)病溫度在20～25℃區(qū)間內(nèi)的結(jié)論相一致。試驗(yàn)中孢子濃度隨著時(shí)間的推移可以下降到原濃度的1 000倍以下，但是通過對(duì)判斷水體中生物活動(dòng)的主要指標(biāo)電導(dǎo)率、溶氧量及化學(xué)需氧量指標(biāo)的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)在此期間水中的微生物數(shù)量呈上升趨勢(shì)且活動(dòng)十分的劇烈，這與孢子濃度隨水溫升高而增加的結(jié)果測(cè)定結(jié)果相吻合，說明隨溫度的增高孢子濃度不斷增加，隨著時(shí)間推移水體中孢子濃度降低但根腫病數(shù)量呈上升趨勢(shì)且活動(dòng)十分的劇烈。但是與田間環(huán)境可能存在較大的差異，這是否會(huì)對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果造成影響還有待進(jìn)一步的研究。除此之外，光照、pH、有機(jī)質(zhì)含量等因素也會(huì)對(duì)根腫菌孢子的存活造成一定的影響，還需要更進(jìn)一步的研究闡明這些因素與水體中根腫菌存活能力存在著怎樣的聯(lián)系。