2個不同番茄品系fasciated基因克隆及表達載體構(gòu)建

劉 爽

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002)

20世紀(jì)以來，我國番茄生產(chǎn)中畸形果發(fā)生率高達20%以上，特別是冬春季節(jié)溫室番茄生產(chǎn)中畸形果發(fā)生率更高。在大果型番茄品種中，每一花序最先開的花畸形果發(fā)生最多，以第一花序畸形果發(fā)生率最高，這嚴(yán)重影響番茄的食用品質(zhì)，且果實畸形，外觀品質(zhì)欠佳，亦影響銷售，在生產(chǎn)中造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。因此，許多科技工作者就如何減少番茄畸形果的發(fā)生進行了一系列的研究，目前已經(jīng)明確了番茄心室數(shù)是產(chǎn)生畸形果的主要原因，即心室數(shù)越多，果實越大，越易產(chǎn)生畸形果；而隨著心室數(shù)的減少，果實逐漸變小，畸形果亦降低[2-4]。番茄心室的形成既與其本身的遺傳特性有關(guān)[2]，又與植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、溫度、光照、營養(yǎng)等條件有關(guān)，各種外界環(huán)境均是通過影響番茄本身的遺傳基因的表達而對番茄心室形成起作用的[3-5]。

2008年Cong等利用圖位克隆的方法成功獲得fasciated基因，該基因通過堿基突變或轉(zhuǎn)錄水平的變化控制番茄心室的形成，并經(jīng)過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗證，確認是主要的控制番茄心室形成的基因[6]。本試驗中的2個供試番茄品系是經(jīng)過多代自交已完全純合的材料，分別命名為多心室MLK1和少心室FL1番茄，心室數(shù)差異明顯，但fasciated的序列未知。為了明確該基因在2個供試材料中的序列差異，明確供試番茄材料的心室數(shù)差異是否由fasciated序列差異或是轉(zhuǎn)錄水平差異引起，同時為了進一步通過該基因的過表達和沉默植株研究其調(diào)控機理，進行了本試驗。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌種和質(zhì)粒

1.1.1 植物材料 試驗材料：少心室番茄品系FL1(心室 2～3個)，多心室番茄品系MLK1(心室15個左右)，由筆者所在實驗室經(jīng)多代自交獲得，二者心室數(shù)及果實大小差異明顯。

1.1.2 入門克隆載體 pENTR/D-TOPO?、卡那霉素抗性、pCR?8/GW/TOPO?、壯觀霉素抗性，統(tǒng)一購自美國英杰(Invitrogen)生命技術(shù)有限公司。

1.1.3 植物表達載體 pMDC141(超量表達載體)和pB7GWIWG2(Ⅰ)(RNAi載體)，分別以抗潮霉素hyg基因和抗除草劑bar基因作為篩選標(biāo)記，2個載體均由筆者所在實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 菌種 pGEM-T載體及大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.5 主要試劑 瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒、Gateway LR Clonase Enzyme MixⅡ購自Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶、rTaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶以及PrimerSTAR HS聚合酶和dNTP購自大連寶生物工程有限公司。M-MLV RT及RNase抑制劑購自普洛麥格(Promega)公司。其他常規(guī)試劑采用進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 2種不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated的擴增 根據(jù)Genebank中fasciated的序列EU557674(783 bp)，用Primer 5.0跨基因特異序列進行引物設(shè)計，由Invitrogen公司合成。引物序列如表1所示。

提取幼嫩番茄葉片總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR后用fas-f-1、fas-f-1′分別擴增FL1、MLK1番茄中的fasciated基因序列(包括全部的編碼序列)，切膠回收后連入pENTR/D-TOPO?載體中，挑取單克隆，由Invitrogen公司進行測序后，進行序列比對。

表1 本試驗所使用的引物序列

1.2.2 入門克隆建立及植物表達載體的構(gòu)建 本試驗采用GATEWAY技術(shù)構(gòu)建植物表達載體。首先，利用引物fas-f-1、fas-f-1′分別擴增FL1、MLK1番茄中的fasciated基因，經(jīng)過膠回收后將該片段分別連接到pCR?8/GW/TOPO?和pENTR/D-TOPO?入門克隆載體中，用通用引物M13+測序驗證序列及連入方向的正確，通過LR反應(yīng)將該基因片段最終置換到表達載體中，再通過酶切及測序的方式驗證正確后將其通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中去，-80 ℃保存待用。

1.2.3 LR克隆及熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (1)于室溫添加LR克隆反應(yīng)體系(入門載體(PENTR質(zhì)粒DNA)100 ng，目的載體(質(zhì)粒DNA)150 ng，加ddH2O至終體積8 μL)至PCR管內(nèi)。(2)將LR ClonaseⅡ置于冰上，每個樣品加2 μL，柔和混勻(勿抽打)后于25 ℃反應(yīng)1～48 h。(3)每個樣品加1 μL Proteinase K(蛋白酶K)，柔和混勻(勿抽打)后于37 ℃反應(yīng)10 min。(4)取2 μL LR克隆反應(yīng)物加入大腸桿菌E.coli感受態(tài)細胞，置于冰上5～30 min。(5)42 ℃熱擊90 s，置于冰上2～3 min，加入500 μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基。(6)37 ℃，100～150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。(7)4 000 r/min低速離心1 min，取200 μL涂布于含有 100 mg/L 表達載體抗性的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated的擴增

取兩葉一心時期的多心室和少心室番茄莖尖生長點，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于fasciated擴增，擴增的片段包括fasciated的全部編碼序列(34～567 bp)，長為551 bp，如圖1所示。

2.2 2個不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated序列比對

用DNAman進行序列比對，結(jié)果如圖2所示，2個不同番茄品系中fasciated基因的編碼序列完全一致。

2.3 2個不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated表達載體構(gòu)建的酶切檢測

首先用特異性引物對LR反應(yīng)的單克隆質(zhì)粒DNA進行PCR檢測，初步驗證fasciated片段整合進入目的載體。然后對RNAi載體通過限制性內(nèi)切酶酶切驗證fasciated片段整合的正確性，特別是RNAi載體中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。對超表達載體筆者直接進行了測序并進行序列的比對，測出的序列中帶有部分載體序列(attB序列)，以確保插入序列的完全正確性。

筆者選用了3種酶對構(gòu)建的RNAi載體進行酶切驗證，分別是EcoRⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ，如圖3-A所示，用EcoRⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ3種酶切LR反應(yīng)前的載體pB7GWIWG2分別能切出3 237、3 180、2 167 bp的片段；LR反應(yīng)之后的載體用Hind Ⅲ酶切可以切出196 bp的片段以及另外2個大小的片段，這3個片段總長為2 148 bp，因為本連入片段分別在293、488 bp有該酶的酶切位點，XbaⅠ可以切出 584 bp+fas(551 bp)長度的片段，而EcoRⅠ酶切位點位于ccdB基因上，因此LR反應(yīng)后不能切出片段。

對于超表達載體的構(gòu)建，采用序列比對檢測，測序得到的序列中包括了完整的PCR產(chǎn)物片段(551 bp)，并且測得attB2的互補序列，說明載體構(gòu)建準(zhǔn)確無誤，可以用于下一步的試驗(圖4)。

2.4 2個不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated表達載體PCR檢測

終載體的檢測采用了質(zhì)粒PCR的方法，挑取多個單克隆，以水和空載體質(zhì)粒為對照進行PCR，結(jié)果如圖5所示：對照沒有目的片段出現(xiàn)，而選擇的終載體質(zhì)粒擴增出了目的片段，說明載體已經(jīng)構(gòu)建成功。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本試驗經(jīng)過擴增得到的fasciated基因序列與Cong等的研究結(jié)果一致，說明該基因在相同作物中具有高度保守性，在供試番茄材料的心室差異并不是由于二者的cDNA序列差異造成的；同時也進行了2個供試材料fasciated基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較，發(fā)現(xiàn)少心室番茄FL1比MLK1的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著[5]。在這一點上，試驗結(jié)果同Cong等是相同的[6]，即在番茄心室數(shù)差異明顯的番茄植株中，fasciated轉(zhuǎn)錄水平差異明顯。因此，為了更深入地研究不同材料中fasciated基因的調(diào)控作用，進行了該基因的過表達與RNAi表達載體的構(gòu)建。

對于植物表達載體的構(gòu)建，采用了Gateway技術(shù)，該技術(shù)可以高效、準(zhǔn)確地構(gòu)建表達載體，操作簡便，反應(yīng)條件易于控制，反應(yīng)后陽性克隆只通過PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳即可檢測，從而為植物基因功能研究提供了強有力的支持。而筆者采用的方法是在傳統(tǒng)的基礎(chǔ)上略加進步的載體構(gòu)建方式，即利用最新的入門克隆載體，該載體上已經(jīng)連入attL序列，這樣就跳過了BP反應(yīng)，直接將純化回收后的PCR產(chǎn)物通過TOPO克隆反應(yīng)連入入門克隆載體就可以進行LR反應(yīng)了，與傳統(tǒng)BP加LR反應(yīng)相比更加方便快捷。在選擇入門克隆的時候要注意入門克隆載體與表達載體的抗性，二者的抗性要求是不同的，這樣也方便后續(xù)篩選陽性克隆，本試驗構(gòu)建RNAi載體的入門克隆在片段連入時對連入的方向也進行了選擇，所以在設(shè)計引物時在前引物的5′端增加了CACC 4個堿基。本試驗應(yīng)用的Gateway技術(shù)構(gòu)建載體操作簡單，省去了大量的酶切、測序等驗證步驟，是一種簡便、高效植物表達載體構(gòu)建技術(shù)。

3.2 結(jié)論

本試驗對供試的2個番茄品系的fasciated基因部分序列(551 bp，包括完整的編碼序列)進行了比對，發(fā)現(xiàn)2個供試番茄材料中該基因序列完全一致。

同時利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了fasciated基因的RNAi及超表達載體，準(zhǔn)備將其分別轉(zhuǎn)錄到少心室番茄FL1和MLK1中去，為進一步研究該基因與心室之間的關(guān)系做準(zhǔn)備。