美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質結構及功能的生物信息學分析

王亞琪， 郭 敏， 劉錚鑄， 耿立英， 張傳生， 鞏元芳， 李祥龍， 彭永東

(河北科技師范學院動物科技學院，河北秦皇島 066004)

水貂皮是一種珍貴的裘皮，顏色多種多樣，價格昂貴，有“裘皮之王”的美稱。貂皮顏色是水貂皮重要的質量品質性狀，也是影響其價格的重要因素。毛色的種類繁多，主要由黑色素的種類與分布不同控制[1]。黑色素是一種廣泛存在于動物、植物和微生物的生物色素，主要分布在人類或動物的皮膚、視網膜、膽囊及卵巢等部位。黑色素的產生或缺乏是動物形成不同毛色的主要物質基礎，而色素的形成是由不同基因間的相互作用與環境因素共同決定。哺乳動物的毛色是由黑色素細胞產生的2種不同類型的黑色素——真黑素(eumelanin)和褐黑素(pheomelanin)的分布以及二者的比例決定的[2]。

酪氨酸酶相關蛋白質1(TYRP1)，由gp75基因表達，又稱為brown蛋白質，是第1個克隆成功的色素基因，該基因與酪氨酸酶編碼蛋白質同源，定位于小鼠的brown位點。小鼠TYRP1基因長約18 kb，定位在第4號染色體，人TYRP1基因長37 kb，定位于染色體9p23，都由8個外顯子和7個內含子組成，由外顯子2-8編碼，TYRP1與TYR基因核酸序列同源達43%；TYRP1與TYR基因mRNA轉錄后加工相似，都有可變性剪接，但不同的是在5′端上游調控區不含有TATA盒和CAATT盒[3-4]。研究表明TYRP1基因的變異與毛色密切相關。小鼠TYRP1基因編碼區中發現1處G/A突變，該突變位點導致氨基酸序列的改變，即半胱氨酸轉變為酪氨酸，并且證實該突變導致棕色表型[5]。在狗中發現TYRP1基因外顯子2錯義突變(S41C)跟棕色表型有關[6]。Schmutz等發現在德克斯特牛(Dexter)中TYRP1基因編碼區一處C/T突變引起組氨酸變為酪氨酸，導致暗褐色表型[7]。索艾綿羊TYRP1基因外顯子4上存在一個非同義性突變(c.869T>C)，與其淺色表型相關[8]。豬TYRP1基因編碼區缺失6個堿基TGGGTA(c.1484_1489del)，與其褐色表型相關[9]。人的金色頭發與TYRP1基因中1個由肌氨酸到精氨酸的錯義突變有關，并使其通過隱性方式遺傳[10]。牛亞茹等發現英國史賓格犬TYRP1基因編碼區存在3個位點(T121A，C991T，P345Δ)多態性與其2種毛色密切相關[11]。郝曄等發現獺兔TYRP1基因編碼區C483T突變有利于真黑色素的合成[12]。

目前，關于水貂TYRP1基因的結構和功能的研究較少。本研究在已有水貂TYRP1基因編碼蛋白質序列的基礎上，利用生物信息學方法對其理化性質、疏水性、信號肽、二級結構、三級結構、亞細胞定位、功能結構域及其功能等進行預測，基于鄰接法對不同物種TYRP1基因進行系統發育分析，以期為研究該基因的結構和功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

美洲水貂TYRP1基因GenBank登錄號為KU186800.1，對該基因完整編碼蛋白質序列進行BLAST分析；與其同源性較高的雪貂(XP_004765815.1)、家犬(NP_001181895.1)、赤狐(ALI89102.1)、北極熊(XP_008688074.1)、家貓(NP_001036025.2)、野豬(ALU33723.1)、綿羊(ACF21681.1)、山羊(AEF01557.1)、牛(AAL38167.2)、小家鼠(CAM22450.1)、大鼠(NP_001100134.1)和人(AAC15468.1)的TYRP1基因完整編碼蛋白質序列下載自NCBI網站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank數據庫。

1.2 方法

1.2.1 水貂TYRP1基因開放閱讀框的確定 通過NCBI中的ORF finder確定水貂TYRP1基因開放閱讀框。

1.2.2 水貂TYRP1基因編碼蛋白質的生物信息學分析 通過ExPASy數據庫(http：//www.expasy.org/)提供的ProtParam在線程序預測該基因編碼蛋白質的氨基酸組成、等電點、正負電荷殘基數、原子總數、摩爾消光系數、半衰期、不穩定指數、脂肪族氨基酸指數、總平均親水性等；通過ProtScale軟件預測疏水性。通過法國里昂CNRS的SOPMA軟件(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測該基因編碼蛋白質的二級結構，并利用SWISS-MODEL軟件[13](https：//swissmodel.expasy.org/)進行三級結構預測。通過NCBI中的CDD數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白質功能結構域。通過CBS Prediction Servers數據庫(http：//www.cbs.dtu.dk /services/)提供的SignalP 4.1 Server在線程序判斷該基因編碼蛋白質是否存在信號肽；通過TMHMM Server v.2.0軟件預測跨膜結構區域；通過Scratch Protein Predictor軟件對該蛋白質的二硫鍵進行預測。通過NetPhos 3.1和NetOGlyc 4.0在線軟件對該蛋白質磷酸化位點和糖基化位點進行預測。通過PSORT Ⅱ Prediction軟件(http：//psort.hgc.jp /form2.html)預測該蛋白質在細胞內的具體存在位置。通過Protfun 2.2 Server軟件[14-15]預測該基因編碼蛋白質的功能分類。

1.2.3 系統發育樹構建 通過BioEdit 7.0軟件[16]對13個物種TYRP1基因編碼蛋白質序列進行同源比對分析，再利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法[17](neighbor-joining method，NJ)構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 美洲水貂TYRP1基因開放閱讀框分析

利用NCBI中的ORF finder對水貂TYRP1基因的開放閱讀框進行定位。起始密碼子位于第5 483個核苷酸，終止密碼子位于第22 380個核苷酸，共編碼537個氨基酸。

2.2 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質理化性質

從表1可知，亮氨酸和脯氨酸的含量較高，分別為8.9%和7.1%；等電點為5.74；帶負電荷氨基酸殘基數(Asp+Glu)為58個，帶正電荷氨基酸殘基數(Arg+Lys)為44個；原子總數為8 351個，其分子式為C2 692H4 076N756O799S28。當所有的半胱氨酸全部形成胱氨酸時，消光系數為82 820 mol/L，相應的吸光度為1.364；當所有的半胱氨酸均不能形成胱氨酸時，消光系數為81 820 mol/L，相應的吸光度為1.348。哺乳動物網織紅細胞的半衰期為30 h。該蛋白質的不穩定指數為 49.47，表明該蛋白質為不穩定蛋白質；脂肪族氨基酸指數為71.90；親水性總平均值為-0.382，表明該蛋白質是親水性蛋白質。

2.3 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質的疏水性和親水性分析

圖1中的正值表示疏水性，該值越大疏水性越強，負值為親水性。由不同的氨基酸得分可知，多肽鏈第84位的精氨酸(Arg)分值最低(-3.133)，其親水性最強；第490位的纈氨酸(Val)和491位的丙氨酸(Ala)分值最高(3.411)，其疏水性最強。整條多態鏈呈親水性，表明TYRP1基因編碼產物為親水蛋白質。

2.4 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質的二級結構和三級結構預測分析

蛋白質二級結構主要指肽鏈中的主鏈借助氫鍵有規則地卷曲折疊成沿一維方向具有周期性結構的構象。使用SOPMA軟件預測水貂TYRP1基因編碼蛋白質二級結構(圖2)，結果表明α-螺旋(alpha helix)和無規卷曲(random coil)是水貂TYRP1蛋白質的主要二級結構元件，其中175個氨基酸(總氨基酸的32.59%)構成α-螺旋， 215個氨基酸(總氨基酸的40.04%)構成無規則卷曲；另外101個氨基酸(總氨基酸的18.81%)和46個氨基酸(總氨基酸的8.57%)分別形成伸展鏈(extended strand)和β-轉角(beta turn)。按照Skolnick等報道的蛋白質二級結構分型標準，水貂TYRP1基因編碼蛋白質二級結構可歸為混合型[18-19]。基于同源建模(預測模板為4d871.B)方法構建的美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質三級結構見圖3。該蛋白質存在較多的扭曲和折疊，結構較為豐富，而這些結構對其生物學功能的發揮有重要作用。

表1 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質的氨基酸組成

2.5 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質結構域預測

應用NCBI中的CDD數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白質功能結構域。從預測結果可知，美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質的第183～417個氨基酸區域為酪氨酸酶超家族(tyrosinase superfamily)結構域(圖4)。

2.6 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質信號肽、跨膜域與二硫鍵預測

由圖5可知，美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質的分值曲線較為典型，其中，C得分(raw cleavage site score)為0.868，Y得分(combined cleavage site score)為0.875，S得分(signal peptide score)為0.943；切割點(cleavage site)在24～25位氨基酸內，因為C得分和Y得分均趨向于1，且S得分在切割點前高，在切割點后迅速變低，可判斷出美洲水貂TYRP1基因編碼產物存在信號肽。

運用TMHMM軟件對該蛋白質跨膜區域進行預測，結果顯示，美洲水貂TYRP1基因編碼產物共有1個跨膜區域：第479～501位(圖6)。第1～478位于胞外，第502～537位于胞內。由此推斷，美洲水貂TYRP1基因編碼產物為1個跨膜蛋白質。

運用Scratch Protein Predictor軟件對該蛋白質的二硫鍵進行預測，結果顯示，水貂TYRP1蛋白質17個Cys中，14個Cys形成了7對二硫鍵。

2.7 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質磷酸化位點和糖基化位點預測

分別應用NetPhos3.1和NetOGlyc4.0在線軟件對水貂TYRP1基因編碼蛋白質磷酸化位點和糖基化位點進行預測，結果顯示，水貂TYRP1蛋白質的氨基酸序列中有53個磷酸化位點和11個糖基化位點。磷酸化位點分別位于絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)殘基上。其中有29個絲氨酸磷酸化位點、19個蘇氨酸磷酸化位點和5個酪氨酸磷酸化位點(圖7)。

2.8 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質的亞細胞定位

通過PSORT Ⅱ Prediction軟件預測水貂TYRP1基因編碼蛋白質的亞細胞定位，結果顯示，該蛋白質存在于內質網、高爾基體和質膜的概率分別為44.4%、33.3%和22.2%，表明該蛋白質主要在內質網中發揮其生物學作用。

2.9 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質的功能分類

由表2可知，美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質在細胞被膜、運輸和結合、嘌呤和嘧啶中發揮的概率較大，分別為 0.804、0.834、0.563，作為信號轉導、免疫應答發揮作用的概率較大，分別為0.148、0.104，明顯高于其他功能。

表2 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質功能分類預測

2.10 系統發育樹

由圖8可知，雪貂(Mustelaputoriusfuro)和美洲水貂(Neovisonvison)之間的親緣關系最為接近，其次是家犬(Canislupusfamiliaris)、赤狐(Vulpesvulpes)、北極熊(Ursusmaritimus)、家貓(Feliscatus)、野豬(Susscrofa)、牛(Bostaurus)、綿羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)、人類(Homosapiens)、大鼠(Rattusnorvegicus)和小家鼠(Musmusculus)。

3 討論與結論

在畜牧業生產中，動物毛色作為重要的經濟性狀，不僅影響動物自身，如由于紫外照射引起的基因突變、偽裝模仿、躲避其他動物的捕食、社會交往和性別選擇[20]，同時對研究動物毛色的形成機制有所幫助。TYRP1基因是第1個克隆成功的色素基因，作為影響動物被毛顏色變異的重要候選基因，近年來得到廣泛關注。TYRP1基因能夠直接影響黑色素的合成，同時能穩定和調節酪氨酸酶的催化活性，對維持黑色素小體結構和黑色素細胞的增殖與凋亡有重要影響[21]。本研究通過生物信息學方法對美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質序列的理化性質、親疏水性、二級結構、三級結構、信號肽、跨膜結構域、二硫鍵、亞細胞定位和功能分類等進行預測和分析，該結果為研究TYRP1基因及其編碼產物的結構和功能提供了更多的信息。

TYRP1基因編碼產物共編碼537個氨基酸，其中亮氨酸含量最高。該蛋白質屬于不穩定蛋白質，整條多肽鏈呈親水性，疏水區主要集中在第5～20個和475～501個氨基酸中，與小鼠和山羊TYRP1基因的蛋白質序列所分析的疏水區域基本相同[22-23]。TYRP1基因編碼蛋白質的二級結構以α-螺旋和無規卷曲為主，存在二硫鍵和信號肽。該基因編碼蛋白質是一種跨膜蛋白質，存在1個跨膜區，并含有1個酪氨酸酶超家族結構域，主要在細胞被膜、嘌呤和嘧啶、運輸和結合中發揮作用，同時還參與細胞的信號轉導、免疫應答。有研究表明，TYRP1基因編碼蛋白質主要在內質網中合成，經高爾基體轉運到前黑色素小體內發揮作用[24-25]，本研究對TYRP1基因編碼產物的亞細胞定位結果與之相符。水貂TYRP1基因與雪貂的親緣關系最為密切，其次是家犬、赤狐、北極熊、家貓、野豬、牛、綿羊、山羊、人類、大鼠和小家鼠，與動物學進化觀點基本一致。由于不同物種間蛋白質的同源性大于25%就可判斷其功能上的相似性[26]。因此，這種同源性不僅反映不同物種間的親緣關系，也表明不同物種TYRP1基因編碼蛋白質在結構上的穩定性，同時說明TYRP1基因編碼蛋白質在長期的生物進化中主要受凈化選擇作用的約束，保守性比較強。

美洲水貂TYRP1基因共編碼537個氨基酸，其編碼產物為不穩定的親水蛋白質。二級結構主要以α-螺旋和無規卷曲為主，含有1個酪氨酸酶超家族結構域，存在信號肽、跨膜結構域和二硫鍵。該蛋白質主要在內質網中發揮細胞被膜、運輸和結合的作用，同時還通過信號轉導在細胞內發揮其生物學作用。系統發育分析表明，美洲水貂TYRP1基因在生物進化過程中符合動物學分類，具有較高的保守性。該生物信息學分析結果為水貂TYRP1基因遺傳特性及編碼蛋白質功能機制的研究提供理論基礎。