棘孢木霉F2菌株對三七灰霉病的生物防治作用

蔣 妮， 白丹宇， 宋利沙， 陳乾平， 馮世鑫， 繆劍華

(廣西藥用植物園，廣西南寧 530023)

三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen]別稱田七，具有散瘀止血、消腫定痛等多種功效，是一種經濟價值較高的中藥材，主產云南、廣西等地區[1-2]。三七性喜溫涼、陰濕的生長環境，易誘發根腐病、黑斑病、炭疽病、灰霉病等多種病害，給三七的栽培生產造成嚴重影響[3]。灰霉病是三七栽培過程中一種重要的病害，目前的防治方法主要以化學防治為主[4]，但長期大量使用農藥容易造成病原菌產生抗藥性、藥材農藥殘留過高、土壤環境污染等問題，而生物防治是一條控制植物病害、減少化學農藥污染的有效途徑[5]。因此，筆者所在項目組開展了利用拮抗微生物防治三七病害的研究工作，從健康三七根際土壤中分離到拮抗木霉菌株——棘孢木霉菌株(標注為F2)，并對三七黑斑病病菌、炭疽病病菌、根腐病病菌等進行生長抑制試驗，結果表明，棘孢木霉F2菌株對三七黑斑病病菌、炭疽病病菌、根腐病病菌的抑菌率較高，分別為88.67%、91.00%、75.76%[6]。在此基礎上，筆者所在項目組開展棘孢木霉F2菌株對三七另一個重要病害——灰霉病的生物防治研究工作，從菌體對病原菌菌絲生長、孢子萌發，以及菌體代謝產物對病害的預防和治療等多方面開展系統的研究，以期為后期開發及田間應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來源

拮抗菌：棘孢木霉(Trichodermaasperellum)F2菌株，從健康三七植株根際土壤中分離得到；致病菌：三七灰霉病病原菌(BotrytiscinereaPers.ex Fr.)、羅漢果斑枯病病原菌(Stagonosporopsiscucurbitacearum)、苦玄參褐斑病病原菌(Alternariaporri)、艾納香條斑病病原菌(Phomaherbarum)、廣西莪術葉斑病病原菌(Phomopsislongicolla)、草豆蔻葉斑病病原菌(Nefusicoccumparvum)，共6種，均為廣西藥用植物園藥用植物病害研究課題組分離純化得到。

1.2 棘孢木霉F2菌株無菌發酵液的制備

將棘孢木霉F2菌株在PDA培養基(200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，1 000 mL水，pH值自然)上活化后，挑取菌絲塊接入PDB培養基(在PDA培養基的基礎上去掉瓊脂)(廣東環凱微生物科技有限公司生產)中，于25 ℃、200 r/min 條件下培養10 d得發酵液，并經 10 000 r/min 離心20 min，去除菌體，取上清液待用。

1.3 棘孢木霉F2菌株對6種藥用植物病原菌的抑制作用及與三七灰霉病病菌的生長競爭作用

將棘孢木霉F2菌株及其他6種致病菌分別接種至PDA培養基，于25 ℃恒溫條件下活化培養7 d，用無菌打孔器分別在菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，接種至同一PDA培養基上進行對峙培養，2個菌餅距離為5 cm，置于25 ℃恒溫培養箱內培養，以只接種病原菌的平板為對照，每個處理重復3次。培養7 d后，測量各處理的菌落直徑，并按照公式計算抑菌率。抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

用無菌打孔器分別在活化的棘孢木霉F2菌株及三七灰霉病病菌菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，接種至同一PDA培養基上進行對峙培養，2個菌餅距離為5 cm，置于25 ℃恒溫培養箱內培養，以只接種灰霉病病菌的平板為對照，每個處理重復3次。每天觀察記錄處理及對照的菌落半徑，共觀察記錄10 d，根據結果繪制對峙培養曲線圖。

1.4 棘孢木霉F2發酵液對三七灰霉病病菌絲生長的影響

采用菌絲生長速率法測定：用50 ℃ PDA培養基將棘孢木霉F2菌株的發酵液原液分別稀釋5、10、20、40倍，充分混勻后倒入直徑為10 cm的培養皿中制成帶藥平板，每個處理重復3次。以無菌水加入PDA培養基作為對照。將培養好的直徑為5 mm的三七灰霉病病原菌接種至處理及對照的平板中央，置于25 ℃恒溫培養箱內培養，24、48、72、96、120 h后用直尺測量菌落直徑，按以下公式計算抑制率：菌絲生長抑制率=(對照菌落增長直徑-藥劑處理菌落增長直徑)/對照菌落增長直徑×100%。

1.5 棘孢木霉F2發酵液對三七灰霉病孢子萌發的影響

采用懸滴法測定：將三七灰霉病病菌培養一定時間后使其產孢，加無菌水配制成10倍物鏡下每個視野50～60個孢子的孢子懸浮液。用孢子懸浮液將棘孢木霉F2菌株的發酵液原液分別稀釋5、10、20、40倍，以孢子懸浮液加入無菌水作為對照(分別記為CK1、CK2、CK3、CK4)，用載玻片懸滴法于 25 ℃ 恒溫條件下培養72 h后鏡檢孢子萌發的情況，計算孢子萌發抑制率。每個處理3次重復。孢子萌發抑制率=(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率)/對照孢子萌發率×100%。

1.6 棘孢木霉F2發酵液對三七灰霉病的防治試驗

1.6.1 棘孢木霉F2發酵液對離體三七葉片灰霉病的防治作用 用無菌水將棘孢木霉F2菌株的發酵液分別稀釋5、10、15、20、40倍，將健康的三七葉片分別浸泡到稀釋的發酵液中，15 min后取出，自然晾干后立即接種直徑為3 mm的灰霉病病菌菌餅，置于培養皿中早晚保濕，25 ℃條件下培養7 d，第8天調查病斑直徑，每個處理10張葉片，重復3次。

1.6.2 棘孢木霉F2菌株無菌發酵液對盆栽三七灰霉病的預防作用 取健康的2年生盆栽三七植株，1株/盆，試驗處理30盆，對照30盆，共60盆。定植30 d后，使用清水稀釋5倍的棘孢木霉F2菌株發酵液進行防治試驗，具體方法：澆灌根部和噴灑葉片同時進行，用100 mL/株棘孢木霉F2菌株發酵稀釋液灌根，10 d 1次，連續5次；20 mL/株棘孢木霉F2菌株發酵稀釋液噴灑葉片正反面，5 d 1次，連續10次。施用棘孢木霉F2菌株發酵稀釋液結束后接種灰霉病病菌，設計2個接種時間，結束后立即接種病原菌(處理1，15盆)，結束7 d后接種病原菌(處理2，15盆)，每株三七隨機取3張葉片分別接種直徑為3 mm的灰霉病病菌菌餅。以相同劑量的清水灌根及噴曬葉片作為對照(分別記為對照1、對照2)，對照病原菌的接種時間、接種量、重復次數與試驗處理相同。接種完成后置于25 ℃人工氣候室中保濕培養7、15 d后調查病斑大小，計算相對防效。

1.6.3 棘孢木霉F2菌株無菌發酵液對盆栽三七灰霉病的防治作用 取健康的2年生盆栽三七植株，1株/盆，試驗處理30盆，對照30盆，共60盆。定植30 d后，每株三七隨機取3張葉片，分別接種1個直徑為3 mm的灰霉病病菌菌餅，置于25 ℃人工氣候室中保濕培養7 d發病后調查病斑大小，隨后噴霧棘孢木霉F2菌株發酵液稀釋5倍，20 mL/株連續噴10次，每次間隔5 d，以噴施相同劑量的清水最為對照，用藥結束5 d后調查葉片病斑大小，計算相對防效。

上述試驗除盆栽試驗是在廣西藥用植物園科研大棚中進行外，其他試驗均是在廣西藥用植物園植病研究室進行，試驗時間為2016年12月至2017年10月。

2 結果與分析

2.1 棘孢木霉F2菌株對6種藥用植物病原菌的抑制效果及與三七灰霉病病菌的競爭關系

由表1可知，通過平板對峙培養試驗，棘孢木霉F2菌株對供試的6種藥用植物病原菌均有較強的抑制作用，其中對三七灰霉病、艾納香條斑病、苦玄參褐斑病、廣西莪術葉斑病的病原菌的抑制率分別達100.00%、98.55%、98.00%、98.00%；對草豆蔻葉斑病病菌、羅漢果斑枯病病原菌的抑制率分別為94.46%、92.38%。在試驗過程中觀察發現，與病原菌同時培養的木霉菌菌絲生長較快，能迅速占領生長空間，將病原菌包圍，使其生長受到抑制，說明棘孢木霉F2菌株與病原菌之間存在生長競爭關系。由圖1可知，對峙培養第5天，灰霉菌和棘孢木霉F2菌株的菌落半徑分別為20、30 mm，此時兩菌交界；對峙培養第6天，棘孢木霉F2菌株繼續生長擴展，并逐漸將灰霉菌菌落包圍，灰霉菌菌落停止生長并逐漸萎縮；培養至第10天，灰霉菌菌落半徑縮至2 mm，最后棘孢木霉F2菌株全部將灰霉菌覆蓋，灰霉菌落完全萎縮。

表1 棘孢木霉F2菌株對6種藥用植物病原菌菌絲的抑制效果

注：同列數據后小寫英文字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.2 棘孢木霉F2菌株發酵液對三七灰霉病菌絲生長的影響

由表2可知，棘孢木霉F2菌株發酵液稀釋5、10、20、40倍對三七灰霉病菌絲均有不同程度的抑制作用，培養 24～72 h 內，隨著作用時間延長，抑制率隨之升高，并在培養 96 h 后，各處理對病原菌的抑制率達到最大值，并在120 h內保持不變。棘孢木霉F2菌株發酵液稀釋5倍，作用96 h，對三七灰霉病菌絲的生長抑制率可達92.6%；稀釋10倍，作用 96 h，抑制率可達88.8%；稀釋20倍，隨著濃度的降低，作用96 h后抑制率降低為75.4%；稀釋40倍，作用96 h后，抑制率降低至為65.2%。結果表明，較高濃度(稀釋5～10倍)的棘孢木霉F2菌株發酵液對三七灰霉病菌絲具有較強抑制作用。

表2 棘孢木霉F2菌株發酵液對三七灰霉病病菌絲生長的抑制作用

2.3 棘孢木霉F2菌株發酵液對三七灰霉病孢子萌發的影響

由表3可知，棘孢木霉F2菌株發酵液稀釋5、10、20、40倍對三七灰霉病孢子的萌發均有一定的抑制作用，其中稀釋5倍，處理72 h后孢子萌發抑制率為82.6%，效果最佳，而稀釋至40倍，孢子萌發抑制率為34.5%，效果最弱。在試驗過程中還觀察到，有部分孢子雖然萌發，但出現畸形現象，后續也難進一步發育。

表3 棘孢木霉F2菌株發酵液對三七灰霉病孢子萌發的抑制效果

2.4 棘孢木霉F2菌株發酵液對離體三七葉片灰霉病的防治作用

由表4可知，棘孢木霉F2菌株發酵液對離體三七葉片灰霉病有一定的防治效果，其中發酵液稀釋5、10倍時，防治效果較好，相對防效分別為74.0%、70.3%，顯著高于其他3個處理濃度。而隨著濃度的降低防效也隨之降低，當發酵液稀釋至40倍時，相對防效<50%。

表4 棘孢木霉F2菌株發酵液對離體三七葉片灰霉病的防治效果

2.5 棘孢木霉F2菌株無菌發酵液對盆栽三七灰霉病的防治

2.5.1 棘孢木霉F2菌株發酵液對三七灰霉病的預防作用 三七灰霉病發病前通過用棘孢木霉F2菌株發酵液灌根并結合葉面噴施進行預防試驗，由表5可知，病害的發生得到較好的抑制。處理1，接種病原菌7、15 d后相對防效為分別為83.4%、81.7%；處理2，接種病原菌7、15 d后相對防效為分別為80.3%、78.9%。處理1是在預防措施結束后立即接種病原菌，處理2是在預防措施結束7 d后才接種病原菌，從相對防效試驗結果來看，二者差異并不顯著。可見，棘孢木霉F2菌株發酵液對三七灰霉病的預防作用具有一定的持效性，在使用7 d后還能維持較好的防效；另一方面，還有可能是對健康三七提前灌根及葉片噴施棘孢木霉F2菌株發酵液，可誘導三七植株對灰霉病產生抗性，因此即使是停止使用一段時間，對灰霉病病菌的侵染仍具有較好的抑制作用。

表5 棘孢木霉F2菌株發酵液對盆栽三七灰霉病的預防效果

2.5.2 棘孢木霉F2菌株發酵液對盆栽三七灰霉病的防治作用 由表6可知，盆栽三七灰霉病發生后，噴施棘孢木霉F2菌株發酵液可以起到一定的防治作用，相對防效為52.6%，但明顯低于預防的效果。可見，棘孢木霉F2菌株發酵液對三七灰霉病的防治應采用預防措施，即在病害發生前，可以通過灌根并結合葉片噴施進行預防，可起到較好的防治作用。

表6 棘孢木霉F2菌株發酵液對盆栽三七灰霉病的治療效果

3 結論與討論

木霉屬真菌是迄今為止用于防治植物病害的生防菌中研究、利用最多的植物病原拮抗真菌，常見的拮抗植物病原菌的木霉屬真菌有哈茨木霉、綠色木霉、鉤狀木霉、長枝木霉、康氏木霉、綠粘帚霉等[7]。棘孢木霉(T.asperellum)是2005年才在我國有記錄的木霉菌菌種[8]，雖然研究剛起步，但多項研究表明棘孢木霉是重要的生物防治菌，通過競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導植物抗病性、促進植物生長、協同拮抗等機制防治植物病害[9]。

競爭作用是生防菌發揮作用的重要機制之一，Chen等認為當一種生防菌能夠與病原菌或其他微生物有效競爭生態位點和營養物質時，它才能夠在根際微生態區系中占有相當的比例，這也是其能否在田間取得理想防效的關鍵[10]。本試驗中供試的生防菌——棘孢木霉F2菌株是從健康的三七根系土壤中分離篩選獲得。對峙試驗結果表明，棘孢木霉F2菌株與三七灰霉病病菌等6種藥用植物病原菌共同培養時表現出較強的空間競爭力，能夠將病原菌迅速覆蓋，競爭到有限的營養，從而抑制了病原菌的生長。棘孢木霉F2菌株對三七灰霉病病菌更是表現出極強的競爭性，抑制率達100.00%，極具生防潛力。

木霉屬中很多種真菌均能夠分泌出抗菌物質，從而抑制其他生物的生長[11]。本研究結果表明，棘孢木霉F2菌株的發酵液能夠較好地抑制三七灰霉病病原菌菌絲的生長以及病原孢子的萌發；對離體三七葉片灰霉病的防效可達74.00%。可見，棘孢木霉F2菌株發酵液中可能含有對三七灰霉病病原菌菌絲及孢子有抑制活性的代謝產物，可進一步研究開發。

木霉屬真菌還有一個重要的抗病機制，能誘導植物抗病[12]。魏林等用哈茨木霉T2-16菌株的發酵代謝產物對豇豆種子進行浸泡處理，結果降低了豇豆枯萎病的發病率，使豇豆對枯萎病產生了抗性[13]。盆栽防治試驗結果表明，在發病前連續一段時間內采用棘孢木霉F2菌株發酵液灌根并結合葉片噴施，對三七灰霉病的相對防效可達83.4%；而在病害發生后才使用，相對防效為52.6%。可見棘孢木霉F2菌株發酵液對三七灰霉病的預防作用要強于治療作用。綜合上述木霉屬真菌誘導抗性的研究結果，分析其原因之一有可能是棘孢木霉F2發酵液可以誘導三七植株對灰霉病產生抗性，還須進一步研究論證。