大鼠尿液與糞便中氟噻草胺的UPLC-MS/MS法測定

余 洋，林立紅*，李曉磊，李 娜，鄭鴻薇，羅雪琪

(1.沈陽化工研究院有限公司 安全評價中心，遼寧 沈陽 110141；2.沈陽化工大學 應用化學學院，遼寧 沈陽 110020)

我國是農業大國，農藥在農業發展中占有重要地位[1]。其中除草劑在農藥使用中占比很大，我國除草劑的使用呈現與日俱增的趨勢，增速達每年200萬hm2[2]。農藥的使用情況與人體健康息息相關，化學除草劑的大量使用對人體健康會產生一定危害，所以除草劑的安全問題日益受到研究者的重視[3]。對于農藥安全問題的研究主要包括其在作物上的殘留、對環境的影響以及對哺乳動物的毒性[4-8]方面。氟噻草胺是拜耳公司研發的一種新型芳氧酰胺類除草劑，主要用于玉米、谷類、棉花、花生、土豆、大米、大豆、向日葵、西紅柿等作物，防除眾多一年生禾本科雜草(如多花黑麥草等)和部分闊葉雜草[9]。目前對氟噻草胺的研究多集中于其與其他除草劑的合用[10-11]，以及在環境、谷物等中的殘留與毒性檢測[12-14]，而關于其在動物體內的研究相對較少，尚未見其大鼠排泄研究的相關報道。體內研究對于農藥研發、毒理作用機制、毒物的安全性評價以及中毒解救有重要意義。因此本文建立了快速、高效的超高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法對氟噻草胺在大鼠體內的排泄情況進行研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A/API3200液質聯用儀，配備Analyst 1.5.1操作軟件；Sartorius BSA3233S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)；KQ5200B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SIGMA 3K15高速離心機(美國Sigma公司)；QT-1渦旋振蕩器(上海琪特分析儀器有限公司)；T18 basic新型高速分散機(德國IKA公司)；移液器(德國Eppendorf公司)。

氟噻草胺(沈陽化工研究院新藥所)；啶氧菌酯(內標，沈陽化工研究院農標室)；乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；甲酸(色譜純，阿拉丁試劑有限公司)；玉米油(中糧食品營銷有限公司)；超純水(自制)。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠，由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(遼) 2015-0001。動物室溫度19～26 ℃，濕度：40%～70%，照明：150～300 Lux(明暗各12 h)，噪音在60 dB以下。動物的使用經本中心倫理委員會審批通過。實驗前所有SD大鼠以動物飼料為全價顆粒飼料飼養于塑料動物盒內，自由進食飲水，適應性飼養5 d。之后將每只大鼠分別飼養于一個不銹鋼籠內，給藥前禁食約18 h，均采用灌胃方式染毒，染毒容積10 mL/kg。

1.3 色譜-質譜條件

色譜條件：Phenomenex反向C18色譜柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)；流速0.6 mL/min；柱溫：室溫；進樣體積：10 μL；流動相：0.1%甲酸水-乙腈(28∶72)；等度洗脫。

質譜條件：離子源：ESI源；離子源溫度：450 ℃；噴霧電壓：5 000 V；碰撞氣:20 685 Pa;去簇電壓:28.00 V;射入電壓:5.20 V;碰撞室入口電壓:20.73 V;碰撞室出口電壓:11.00 V;GAS1:344 750 Pa;GAS2:379 225 Pa;氣簾氣：172 375 Pa；檢測方式：多反應監測(MRM)；氟噻草胺與內標(啶氧菌酯)的定量離子對分別為m/z364.1/194.2和m/z368.1/145.2；碰撞能量分別為14.00 eV和26.00 eV。

1.4 標準溶液的配制

標準儲備液：精密稱取氟噻草胺適量，加乙腈溶解并定容至100 mL，得質量濃度為1 g/L的標準儲備溶液，于-20 ℃下貯存。

標準工作溶液(用于尿液)：精密量取適量儲備液，用乙腈稀釋為0.50、1.00、2.00、5.00、12.5、25.0、50.0 mg/L的氟噻草胺系列標準溶液;質控(QC)工作溶液：1.25 mg/L(低濃度質控，LQC)、5.00 mg/L(中濃度質控，MQC)、40.0 mg/L(高濃度質控，HQC)。

標準工作溶液(用于糞便)：精密量取適量儲備液，用乙腈稀釋為1.25、2.50、6.25、20.0、50.0、125、250 mg/L的氟噻草胺系列標準溶液;QC工作溶液：3.75 mg/L(LQC)、25.0 mg/L(MQC)、200 mg/L(HQC)。

內標溶液：精密稱取啶氧菌酯適量于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，得到質量濃度為1 g/L的內標儲備液。精密量取該儲備液，用乙腈分別稀釋成2.50 mg/L(用于尿液)和20.0 mg/L(用于糞便)的內標工作溶液。

1.5 樣品采集

取大鼠6只，給藥組5只(400 mg/kg)，空白溶液對照組1只。給藥前禁食18 h，以經口灌胃法一次給足設計劑量，給藥容積為0.1 mL/kg體重，給藥后將大鼠放回飼養籠內，自由進食、飲水。收集大鼠0～7 h、7～24 h、24～48 h、48～72 h、72～96 h、96～144 h的尿樣和糞樣，各時間段的尿樣合并后記錄總體積，混合均勻，置于凍存管內；各時間段的糞樣收集后合并稱重，裝入廣口塑料瓶中，-20 ℃冷凍待測。末次收集樣品后采用乙腈清洗糞尿收集管，記錄總體積，置于凍存管內，-20 ℃冷凍待測。

1.6 樣品處理

空白糞樣提取液：取大鼠空白糞樣適量，加入5倍量的乙腈溶液，勻漿均勻，4 ℃下以15 000 r/min離心10 min，取上清液即得。

糞便樣品前處理：將糞樣室溫解凍，加入5倍量的乙腈溶液，勻漿均勻，4 ℃下以15 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，加入20 μL 內標，渦旋混勻后，取液體適量用80%乙腈溶液稀釋100倍，進行儀器分析。

尿液樣品：將樣品室溫解凍混勻，取尿液100 μL，加入20 μL 內標，渦旋混勻，再加入乙腈200 μL混勻，4 ℃下以15 000 r/min離心10 min，取上清液適量，用70%乙腈溶液稀釋50倍，進行儀器分析。

糞尿清洗液：將糞尿清洗液室溫解凍，混勻，取100 μL，加入20 μL內標，渦旋混勻，再加入乙腈200 μL混勻，4 ℃下以15 000 r/min離心10 min，取上清液適量，用70%乙腈溶液稀釋50倍，進行儀器分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

分別考察了甲醇和乙腈作為有機相，超純水和乙酸銨作為水相時對氟噻草胺響應值的影響，結果發現以乙腈-超純水為流動相時，氟噻草胺的響應較好，且在水相中添加0.1%甲酸，可增加ESI+模式下的離子化效率。

流動相中有機相與水相的不同配比對待測物的保留時間與響應有很大影響。實驗考察了乙腈-0.1%甲酸水(85∶15)、乙腈-0.1%甲酸水(80∶20)、乙腈-0.1%甲酸水(70∶30)作為流動相時的分離效果，發現乙腈-0.1%甲酸水(70∶30)作為流動相時出峰時間合適。進一步優化發現以乙腈-0.1%甲酸(72∶28)作為流動相可縮短分析時間，且內源性物質對待測物及內標的測定無干擾。在“1.3”色譜條件下，尿液中氟噻草胺及內標的典型色譜圖見圖1。

2.2 方法學考察

2.2.1標準曲線與定量下限用空白尿液與空白糞便提取液將對應工作溶液稀釋成一系列質量濃度為0.10、0.20、0.40、1.00、2.50、5.00、10.0 mg/L(尿液)；0.25、0.50、1.25、4.00、10.0、25.0、50.0 mg/L(糞便)的氟噻草胺標準溶液樣品，按照“1.3”條件進行分析，以質量濃度(X,mg/L)為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值(Y)為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，氟噻草胺在0.10～10.0 mg/L(尿液)及0.25～50.0 mg/L(糞便)范圍內線性關系良好，相關系數分別為0.999 0和0.995 8。

在空白尿液與糞便樣品中添加氟噻草胺對照品，以信噪比S/N≥10計算方法的定量下限(LOQ)。結果表明，氟噻草胺在大鼠尿液與糞便中的LOQ分別為0.10、0.25 mg/L。

2.2.2準確度與精密度以空白尿液、糞便提取液為基質將質控樣品工作溶液稀釋成低、中、高(尿液：0.25、1.00、8.00 mg/L;糞便：0.75、5.00、40.0 mg/L) 3個質量濃度的質控樣品各5份，在優化條件下測定，通過方差分析計算方法的精密度和準確度。連續測定3 d，獲得日間與日內相對標準偏差(RSD)，結果見表1。尿液和糞便基質中準確度為94.8%～109%；日間與日內精密度為3.6%～9.9%；由結果可知，方法的精密度和準確度符合《中國藥典》(2015版)第四部《9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則》的相關要求。

表1 氟噻草胺在尿液和糞便中的準確度和精密度Table 1 Precision and accuracy for the determination of flufenacet in urine and feces

2.2.3加標回收率與基質效應考察了尿液樣品的加標回收率與基質效應。以空白尿液為基質將QC工作溶液稀釋成低、中、高3個質量濃度(0.25、1.00、8.00 mg/L)的質控樣品各5份，在優化條件下測得氟噻草胺的峰面積A；另取大鼠空白尿液樣品，先加入渦旋混勻的QC工作溶液和內標溶液，再加入等量低、中、高3個濃度的QC工作溶液和內標溶液，每個濃度平行5個樣品，分析獲得相應峰面積B；另以流動相替代空白尿液，加入低、中、高3個濃度的QC工作溶液，按“1.6”方法操作，每一濃度平行5個樣本，分析獲得相應峰面積C。以A/B×100%計算加標回收率，以B/C×100%計算基質效應。

結果表明，尿液基質中，該方法的加標回收率為97.0%～98.8%，RSD為0.5%～9.0%；基質效應為98.8%～107%，RSD為1.1%～3.4%，表明該分析方法不存在基質效應；加標回收率和基質效應符合《中國藥典》(2015版)第四部《9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則》的相關要求。

表2 尿液與糞便樣品中氟噻草胺的排泄率和累積排泄率Table 2 The excretion rate and total accumulated excretion rate of flufenacet in urine and feces

2.2.4穩定性考察以空白尿液、糞便提取液配制2個質量濃度(尿液：0.25、8.00 mg/L;糞便：0.75、40.0 mg/L)的質控樣品各5 份。考察了尿液樣品(3次凍融循環、室溫放置4 h、處理后進樣器放置24 h、生物樣品-20 ℃下放置15 d和30 d)，以及糞便樣品(室溫放置4 h、處理后進樣器放置24 h)的穩定性。得到尿液與糞便中穩定性樣品的峰面積占新鮮配制樣品峰面積的比例分別為93.7%～108%和97.5%～102%，穩定性結果在85%～115%范圍內，表明氟噻草胺在以上的儲存條件下穩定，符合實驗要求。

2.3 實際樣品的測定

大鼠單次經口染毒98%氟噻草胺原藥400 mg/kg后，收集大鼠0～7 h、7～24 h、24～48 h、48～72 h、72～96 h、96～144 h的尿樣和糞樣，按照本方法處理后進行測定，尿液與糞便中氟噻草胺在各時間段的排泄率和累積排泄結果見表2。

由表2可知，大鼠經口染毒98%氟噻草胺原藥后，原藥可隨糞、尿排泄。0～144 h內的總排泄率為12.62%，其中尿中的累積排泄率為1.12%，糞中的累積排泄率為10.13%，糞尿淋洗液的累積排泄率為1.37%；說明氟噻草胺在大鼠體內主要經糞便排泄。大鼠排泄后，代謝籠、糞管、尿管上會有殘留，用100 mL乙腈充分沖洗獲得糞尿淋洗液并進行測定，以保證總排泄率計算的準確性。

3 結 論

本文建立了一種測定大鼠尿液、糞便中氟噻草胺濃度的HPLC-MS/MS分析方法。該法高效、專屬、靈敏，符合生物樣品分析方法的要求，可用于尿液、糞便中氟噻草胺的測定。采用建立的方法對給藥后大鼠體內氟噻草胺的排泄動力學進行了研究。結果顯示氟噻草胺原藥在大鼠糞和尿中的排泄率較低，可能由于經口給藥后，原藥在大鼠體內會被廣泛代謝成相關的代謝產物，后續應對其代謝產物做進一步考察研究。