基于小分子化合物分析的MALDI-TOF MS新型基質研究進展

楊迎晨，陳企發，夏 炎，2*

(1.南開大學 化學學院，天津 300071；2.天津市生物傳感與分子識別重點實驗室，天津 300071)

基質輔助激光解吸附離子化-飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是一種新型的軟電離生物質譜，其在理論和操作上均十分簡便、高效，且靈敏度高，近十年來得到了快速發展。MALDI-TOF MS在生物大分子的檢測中應用廣泛，但由于受到傳統有機基質的干擾，其對小分子的檢測面臨著較大的限制。目前主要應用于以下方面：生物大分子(如蛋白質)的鑒定；環境污染物等有機小分子分子量的測定；磷酸肽段、糖肽等生物小分子的檢測。

基質作為影響MALDI-TOF MS實驗結果的重要因素，其選擇一直受到學者的廣泛關注。傳統的有機基質，如α-氰基-4-羥基桂皮酸(CHCA)、2,4,6-三羥基苯乙酮(THAP)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)，雖能夠輔助待測物產生較為強烈的質譜信號，但由于其分子量約為200 Da，在激光的照射下，將在小質量數的范圍內產生大量的基質碎片，碎片化的基質所產生的質譜信號會嚴重干擾小分子的譜圖分析。研究人員擬通過開發新型基質，以達到消除碎片、簡化譜圖的目的，以實現對小分子物質更為精準的檢測。目前，新型MALDI-TOF MS基質可大致分為納米材料及新型有機化合物兩大類[1-4]。本文綜述了近年來這兩種新型基質的制備方法以及用于提高小分子物質檢測精確性的研究進展，并對其發展前景進行了展望。

1 納米材料類基質

納米材料(Nanometermaterial)是結構單元的尺寸介于1～100 nm范圍的一類新型材料，由于其粒徑較小、比表面積大、可修飾性強，在醫藥、催化、傳感、磁性記錄等領域有著良好的應用。用于MALDI-TOF MS基質的納米材料主要包括金屬有機骨架、碳基納米材料、硅基納米材料、金屬粒子及其氧化物等。

1.1 金屬有機骨架類基質

金屬有機骨架材料(MOFs)是金屬中心與有機配體在有機溶劑中，通過配位作用，自組裝形成的具有周期性孔道結構的配位聚合物，常需在高溫、高壓條件下得到。MOFs具有拓撲結構，比表面積和孔隙率高，且孔道具有可修飾性，在氣體吸附、熒光發光、催化、藥物負載[5]等領域受到了學者們的廣泛關注。根據MOFs由金屬中心和有機配體組成這一基本性質，科學家們通過尋找功能化的有機配體與金屬中心結合，合成了既對小分子物質有特異性富集作用又能充當MALDI-TOF MS基質的新型MOFs材料，以實現高效富集、精準檢測。

在MALDI-TOF MS檢測中，要求所合成的MOFs材料對激光光源有很強的吸收作用并產生電離，進而將能量傳遞給被分析物。目前用于制備基質的MOFs金屬中心主要有Zr、Cr、Zn、Cu等，配體主要是多羥基羧酸類配體、吡啶類配體等含多個助色團和生色團的有機化合物。

Ye等[6]以傳統的MALDI-TOF MS有機基質結構為基礎，選取結構類似的有機化合物為配體，設計合成了可同時作為吸附材料和基質的MOFs材料。該課題組選擇2,5-吡啶二羧酸(PDC)和2,5-二羥基對苯二甲酸(DHT)作為合成MOFs的配體，合成了兩種以Zr(Ⅳ)為金屬中心的MOFs材料——UiO-66-PDC 、UiO-66-(OH)2，并將其作為富集材料和MALDI-TOF MS基質用于小分子分析，二者均表現出低干擾性、高離子化效率和良好的重現性等性質。該課題組利用合成的MOFs成功對糖、氨基酸、肽、堿性藥物和天然產物等小分子化合物進行了檢測，所合成的材料對磷酸肽均表現出高靈敏性和特異性富集的特點。

Han等[7]以硝酸鉻(Cr(NO3)3)和對苯二甲酸(H2BDC)合成了經典MOF MIL-101(Cr)，研究表明，MIL-101(Cr)是一種具有高分子量的金屬有機骨架，具有π共軛三維結構和配位不飽和的鉻位點(CUS)，在紫外范圍內具有強吸收。與傳統的有機基質相比，MIL-101(Cr)可以顯著消除背景峰，在小分子分析中顯示出更高的信噪比水平。該課題組利用MIL-101(Cr)作為輔助基質成功檢測了廣泛存在于食品和天然產物中的槲皮素、大豆苷元、木黃酮和柚皮素。

近期，南京師范大學古致遠課題組[8]研發出一種新型的水穩定二維MOF結構——Zn2(bim)4(bim=benzimidazole)，該結構對鹽濃度有著超高的耐受性。該研究以穩定的二維金屬有機骨架納米片為MALDI-TOF MS基質用于正、負離子模式下小生物分子和污染物的分析。在監測神經遞質乙酰膽堿的酶水解時，該基質可在1 000 mmol/L的鹽濃度下保持良好的性能。

上述研究結果表明，通過以傳統MALDI-TOF MS基質為基礎，選取類似結構的有機化合物作為配體，結合不同性質的金屬離子所合成的MOFs，將可能同時作為小分子被測物的富集材料和MALDI-TOF MS基質。與傳統有機基質相比，MOFs在小分子的分析檢測中具有背景無干擾、耐鹽性良好、靈敏度高和重復性好等優點。

1.2 石墨烯納米材料類基質

石墨烯類基質包括石墨烯、石墨烯衍生物及其復合材料。石墨烯(Graphene)是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成的厚度只有1個碳原子的單層片狀結構，具有良好的熱穩定性、導電性、電子運輸能力及機械特性，自問世以來一直受到廣泛關注。許多不同類型的石墨烯衍生物和復合材料被證明可作為MALDI-TOF MS的優良基質，如石墨烯薄片[9]、石墨烯/SiO2納米復合材料[10]和N摻雜石墨烯[11]等。

2010年，Dong等[12]的研究表明，以石墨烯作基質，可以成功分析包括氨基酸、多胺、抗癌藥物和核苷在內的多種極性化合物，同時，類固醇等非極性化合物也可被高分辨率和高靈敏度地檢測。與常規基體相比，石墨烯對非極性化合物表現出更高的解吸/電離效率。此外，該課題組還證明，使用石墨烯作為提取角鯊烯的固相吸附劑可以極大地降低檢出限。以石墨烯作為MALDI-TOF MS的基質時，其可作為捕獲分析物的底物發揮作用，并在激光照射時將能量傳遞給分析物，使得分析物易解吸/離子化，消除了基質離子的干擾，避免了分析物的碎裂，具有良好的重復性和高耐鹽性，在復雜樣品的高通量分析中具有潛在的應用價值。

2011年，Cai等[9]研究了一種直接使用負離子模式分析石墨烯薄片上小分子的新方法。該工作將分析物和石墨烯薄片懸浮液的混合物直接移液至樣品板上用于LDI-TOF MS分析，分析物以多種離子加合的形式被檢出。該方法可用于肽、氨基酸、脂肪酸以及核苷和核苷酸等小分子的檢測，其檢測示意圖如圖1所示。

圖1 石墨烯作基質進行分析物檢測示意圖[9]Fig.1 Image of detecting analytes with graphene as matrix[9]

2018年，Huang等[13]報道了一種基于MALDI-TOF MS，以石墨烯為基質，2,5,6,9-四氯癸烷為內標的快速篩選短鏈氯化石蠟(SCCP)的新方法。該課題組發現使用石墨烯作為MALDI矩陣可對短鏈氯化石蠟產生高強度峰，且背景噪音很少。在優化條件下，短鏈氯化石蠟同系物的檢出限可達0.1～5 ng/mL。該方法已成功應用于室內粉塵樣品中短鏈氯化石蠟的快速篩選以及人類所接觸的短鏈氯化石蠟暴露水平的監測，不僅為SCCP研究提供了新工具，而且進一步證明了石墨烯作為新一代MALDI矩陣的應用前景。石墨烯基質的作用示意圖如圖2所示。

石墨烯復合材料一直是新型材料研究領域的熱點，通過以石墨烯及部分金屬氧化物、硅材料為原料，合成石墨烯復合材料進而改善單一石墨烯的性能，可以制備出用于檢測生物小分子的更加高效、合理的MALDI-TOF MS基質材料。Zhu等[11]首次以氣相N摻雜石墨烯(gNG)為基質，在負離子模式下使用MALDI-TOF MS進行小分子分析，并獲得無基質干擾的去質子化分子、離子峰，從而實現了對氨基酸、脂肪酸、肽、合成代謝雄激素類固醇以及抗癌藥物等多種低分子量(MW)分析物的分析。該研究為氮摻雜石墨烯材料創建了一個新的應用分支，并為小分子分析提供了一種替代解決方案。

1.3 碳納米管類基質

碳納米管(Carbon nanotubes，CNT)是一種碳基材料，可吸收和轉移激光能量并捕獲分析物，在利用MALDI-TOF MS檢測小分子方面發揮著重要作用。

Shi 等[14]通過簡單的水熱反應合成了多壁碳納米管和聚苯胺復合材料(MWCNTs @ PANI)，并成功地將其作為基質用于MALDI-TOF MS檢測(圖3A)。聚苯胺改善了親水性的碳納米管作為基質的性能。受到多壁碳納米管@聚苯胺復合材料的啟發，該團隊還在溫和條件下通過簡單的氧化還原聚合合成了水分散性多巴胺修飾的碳納米管(MWCNT @ PDA)(圖3B)。獲得的新型碳基材料結合了多壁碳納米管和聚多巴胺的性能，相比于原始的MWCNTs，該新型碳基材料應用于MALDI-TOF MS的分析檢測效果更好，具有更高的靈敏度、峰強度和解吸/電離效率。碳納米點是一種新型的碳基材料，由于其吸收效率高，被開發成為一種新型的MALDI-TOF MS基質[1]。碳納米點表面可修飾豐富的羧酸基團，表現出水溶性，因而可均勻分散于溶液中，避免了放電和污染。此外，碳納米點的尺寸較小(～3 nm)，分析物易脫附，檢出限可低至0.2 fmol。同時，碳納米點還具有易制備、可定量、穩定性高、無毒和成本低等優點。

圖3 MWCNTs@PANI復合材料(A)及水分散性MWCNT@PDA復合材料(B)的合成[14]Fig.3 Synthesis of MWCNTs @ PANI composites(A) and water-dispersible MWCNT@PDA composites(B)[14]

最近，Cai等[15]通過液體剝離法制備超薄石墨碳氮化物(g-C3N4)納米片，并將其用作MALDI-TOF MS分析的基質。與有機基質和石墨烯相比，g-C3N4納米片在負離子模式下表現出較好的性能，其靈敏度高，耐鹽性和重復性良好。將其用于污水中1-硝基芘(1-NP)的分析，檢出限可低至1 pmol。

1.4 硅基納米材料類基質

硅基納米材料類基質主要指硅基類介孔材料。介孔材料是一類孔徑在2～50 nm之間的多孔材料，具有極高的比表面積、周期性排列的孔道結構、連續可調的孔徑大小等特點，且通過引入客體分子對孔道進行修飾后可進一步改善介孔材料的性能，使之在分離、吸附、催化等領域能完成很多微孔分子篩難以完成的反應。

Li等[16]制備了一種新型的基于電化學蝕刻多孔硅(PSi)的MALDI基質材料，其表面用鈀納米顆粒(Pd NPs)修飾。該材料可對多肽進行特異性富集。由于孔徑大小限制和PSi的分子濾過效應，血清樣品中的多肽可被選擇性捕獲并富集在孔道中，從而消除了后續MALDI-TOF MS檢測中大蛋白的干擾。另一方面，具有局域表面等離子體共振(LSPR)效應的Pd納米顆粒有助于提高紫外區域的能量吸收效率，增強質譜信號。該技術可在PSi-Pd NPs芯片上直接檢測血清樣品，無需復雜的預處理過程。

Jin等[17]利用有機分子(1,8-萘二甲酰亞胺)對介孔二氧化硅SBA-15材料進行修飾，通過將SBA-15共價連接到由1,8-萘二甲酸酐和3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基胺形成的1,8-萘二甲酰亞胺上，合成了改性的SBA-15基質SBA-15-NA(1,8-萘二甲酰亞胺)。

以SBA-15-NA作為基質獲得的質譜顯示出較少的背景干擾離子，較高的解吸/電離效率及峰強度。該材料可用于分析各種類型的低分子量(小于500)化合物，如單糖、氨基酸、植物激素、藥物，且改性的介孔二氧化硅材料可用于尿液中代謝物的直接檢測。

1.5 金屬納米粒子類基質

金屬納米粒子是尺寸在1～100 nm之間的超細金屬粒子。金屬納米粒子及其氧化物具有較大的比表面積，良好的激光吸收性能，高的表面活性，極小的背景噪音，且種類多樣，是MALDI-TOF MS新型基質的重要組成部分。

目前，用于MALDI-TOF MS的基質主要有Co、Ag、Mo等納米粒子及TiO2、ZrO2等納米氧化物。其中Co納米粒子的應用最早。2000年，Kinumi課題組[18]通過一系列實驗，測定了Mo、Mn、Si、Sn、TiO2、WO3等金屬及金屬氧化物對聚乙二醇200(PEG200)和硬脂酸甲酯的離子化效率。

2018年，Liang課題組[19]報道了一種TiO2輔助激光解吸/電離質譜(TiO2-LDI MS)方法用于細菌細胞代謝物的快速分析，以區分不同菌株并檢測其抗菌素耐藥性(AMR)。通過利用TiO2-LDI MS對細菌代謝產物進行多變量分析以確定細菌特征，進而確定某一種特征代謝物作為潛在的生物標志物。該方法在樣品制備和分析時間等方面具有明顯優勢，為臨床快速分析提供了新方法。Zhao等[20]報道了二硫化鉬納米片/銀納米顆粒(MoS2/Ag)雜合體的簡單合成方法，并證明其可作為負離子模式下MALDI-TOF MS的有效基質。MoS2/Ag納米復合材料作為基質在MALDI-TOF MS檢測中具有解析/電離效率高、破碎干擾小、耐鹽性高和質量信號無干擾等特點，且可同時分析8種不同藥物，并實現了人血清中乙酰水楊酸的定量分析。

2016年，楊夢瑞等[21]研究發現碲化鎘量子點(CdTe量子點)可作為一種新型基質用于全氟癸烷磺酸鹽(PFDS)、全氟己烷磺酸鹽(PFHxS)和全氟庚烷磺酸鹽(PFHpS)等全氟化合物的MALDI-TOF MS分析。與傳統有機基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)相比，在相同的檢測條件下，高濃度的CdTe量子點可有效提高全氟化合物MALDI-TOF MS分析時的峰強度。

此外，Fe3O4/TiO2納米顆粒[22]、ZnO-CuO納米顆粒[23]均可作為MALDI-TOF MS基質以實現對小分子化合物的檢測。而對金屬納米材料進行功能化修飾[24]，則是提升金屬納米材料基質性能的重要手段。

1.6 其他納米材料基質

氮化硼(BN)納米薄片也是一種性能優良的新型基質。聶宗秀等[25]使用六方氮化硼(h-BN)納米片作為全激光脈沖能量范圍中的第一個無背景基質，研究結果顯示，該基質可用于小分子代謝物的富集、分析和成像，在MALDI-TOF MS成像和環境分析方面具有廣闊的應用前景。

共價金屬有機化合物(COF)近年來被開發為新型的質譜檢測基質，通過使用COF作為LDI MS矩陣，不僅可檢測生物微小分子(如氨基酸和脂肪酸)，還可檢測雙酚S(BPS)和芘等環境污染物。以COF為基體，比常規有機基質具有更高的解吸/電離效率和更小的背景干擾。近日，本課題組通過1,3,5-三苯基間苯二酚(Tp)和聯苯胺(BD)合成了TpBD共價有機化合物[26]。TpBD可在非常低的基質劑量(0.1 mg/mL)下通過LDI-MS直接檢測小分子，具有很高的電離效率，良好的耐鹽性和高重復性，且無干擾背景，可實現對氨基酸和脂肪酸等各種小分子及環境污染物的檢測。與傳統的2,5-二羥基苯甲酸(DHB)基質相比，TpBD基質具有良好的重現性和較低的檢出限(0.79 pmol)。

2 新型有機化合物基質

2.1 有機小分子類基質

傳統基質多為有機酸類基質，在激光解離過程中雖有電子轉移過程，但多為質子轉移，對于極性化合物的分析效果較好，但對于非極性或弱極性化合物檢測,離子化效率不高。近年來，幾類有機堿基質也被用于小分子的質譜檢測。9-氨基吖啶是一種中等強度的堿性化合物，Cerruti等[27]以9-氨基吖啶作為基質，在負離子模式下檢測脂質物質，顯著提高了檢測結果，具有優良的信噪比。Shroff等[28]以強堿1,8-雙(二甲基氨基)萘(DMAN)作為MALDI-TOF MS分析陰離子的新基質，成功在生理濃度下對脂肪酸、氨基酸、脂肪酸-氨基酸綴合物、植物和動物激素、維生素和短肽進行了檢測。

應用有機鹽類物質作基質的研究也取得了一定進展。2012年，聶宗秀等[29]將N-(1-萘基)乙二胺二硝酸鹽(NEDN)用作分析小分子(m/z<1 000)的基質，成功分析了寡糖、肽、代謝物和爆炸物等。2013年又使用1-萘基肼鹽酸鹽(NHHC)作為尿液樣品中血清葡萄糖和尿黑酸MALDI-TOF MS分析的新基質[24]。NHHC作為高耐鹽基質，具有成本低、紫外吸收適宜和對低分子量區域干擾小等顯著特點。研究結果表明，與常規技術相比，NHHC輔助的LDI MS方法顯著簡化了樣品預處理程序，并提高了對實際樣品中不同低分子量分析物的檢測靈敏度，降低了檢出限。

2017年，聶宗秀課題組[30]發現N-二(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(NEDC)作為高靈敏度的基質，在檢測二糖異構體時會產生強烈的氯化物附著的二糖離子[M+Cl]-信號，該離子可被片段化并用于快速分析和定量檢測復雜介質中的二糖異構體。近日，該課題組將N-苯基-2-萘胺(PNA)作為MALDI-TOF MS分析和小分子成像的新型基質[31]，PNA輔助大腦中動脈閉塞(MCAO)的大鼠腦組織中小分子的LDI MS成像顯示，在術后24 h對氨基酸、抗氧化劑、游離脂肪酸、磷脂和腦組織中的鞘脂等89個小分子代謝物進行檢測，可鑒定出59個代謝產物，并進行了相對定量和統計分析。

2.2 有機高分子類基質

使用高分子量的基質是另一種有效避免小分子檢測中產生背景干擾的途徑。高分子量的基質在小分子分析區域內僅出現少量的雜質峰，相比于傳統有機基質，其減少背景干擾的性能尤為突出。

1995年，Jones 等[32]發現四羥基苯卟啉(m-THPP) 可作為分析低分子量化合物的基質，進一步的研究表明m-THPP對水溶性維生素也具有很好的離子化效率[33]。五氟苯酚卟啉(F20TPP) 是一種應用較為廣泛的高分子有機基質，Ayorinde等[34]以F20TPP為基質，利用MALDI-TOF MS同時檢測了非酒精飲料中的糖、抗壞血酸、檸檬酸、苯甲酸鈉和苯甲酸鉀。高分子聚合物也被開發應用于MALDI-TOF MS。 Soltzberg等[35]使用一種吸光的導電聚合物作為基質結合MALDI-TOF MS檢測小分子有機物的分子量,獲得了質量范圍為100～300 Da的小分子有機物的分子離子質譜。

3 總結與展望

納米材料及新型有機基質的研究有效拓展了MALDI 技術的應用范圍，使得該技術能夠更加高效、廣泛地應用于小分子的檢測。但在以下方面仍有待深入：①新型基質的研發應更注重實用性、通用性與廉價性；②開發出更多集富集、催化、發光等性能于一體的多功能新型基質；③分析復雜混合物時，MALDI會受到顯著的離子抑制。不同性質的化合物分子共存通常會導致1種或幾種組分優先于其他組分離子化，新的基質若能降低離子抑制效應，將顯著提升MALDI技術的應用效能；④MALDI 質譜活體成像技術是一種新興的分子成像技術，開發適用于藥物小分子 MALDI 成像的新型基質具有良好的前景。