黃芪總提取液對D—半乳糖致大鼠亞急性衰老模型的影響研究

閆晉晉 楊薪正 姚妙 廖國珍

摘 要：目的：觀察黃芪總提取液對D-半乳糖致大鼠亞急性衰老模型的影響。方法：建立D-半乳糖致大鼠亞急性衰老模型，以Y型電迷宮檢測其學習記憶能力，分別采用黃嘌呤氧化酶法、TBA比色法測定大腦SOD活性和MDA含量、硝酸還原酶法測定大腦NO含量，觀察大鼠服用黃芪總提取液后以上指標的變化。結果：與D-半乳糖模型組相比，黃芪總提取液的中、高劑量組可提高亞急性衰老模型大鼠的學習記憶能力（P<0.05），增加D-半乳糖所致衰老模型大鼠大腦SOD活性、降低MDA含量（P<0.05）。各給藥組均起到降低腦組織NO含量，但無法恢復至正常水平。結論：黃芪提取液能改善D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠的多項體征，攝入適量黃芪總提取物可以明顯提高大鼠機體抗氧化、抗衰老能力，從而對D-半乳糖誘發的大鼠衰老起到延緩的效果。

關鍵詞：黃芪提取液；D-半乳糖；衰老；大鼠；學習記憶

中圖分類號：R339.38 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2018）28-0005-04

Abstract： Objective： To observe the effect of total extract of astragalus on subacute aging model of rats induced by D-galactose. Methods： The subacute aging model induced by D-galactose was established in rats. The ability of learning and memory was measured by Y-type electric maze. The activity of SOD and the content of MDA in brain were measured by xanthine oxidase method and TBA colorimetry， and the content of no in brain was determined by nitrate reductase method. The changes of the above indexes were observed after taking the total extract of astragalus membranaceus in rats. Results： Compared with D-galactose model group， middle and high doses of total extract of astragalus could improve the learning and memory ability of subacute aging model rats （P < 0.05）， increase the activity of SOD and decrease the content of MDA in brain of aging model rats induced by D-galactose （P < 0.05）. The content of NO in brain tissue was decreased in each treatment group， but it could not recover to normal level. Conclusion： Astragalus membranaceus extract can improve many signs of subacute aging rats induced by D-galactose. Intake of appropriate amount of total extract of astragalus membranaceus can significantly improve the ability of anti-oxidation and anti-aging of rats. Thus D-galactose induced aging in rats play a delayed effect.

Keywords： astragalus membranaceus extract； D-galactose； aging； rat； learning and memory

黃芪是膜莢黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.或蒙古黃芪 （Astragalus membenanceus（Fisch.） Bge .Var干燥處理后的塊根，屬于豆科（Leguminosae）植物黃芪屬（Astragalus），文獻中記載原名為黃耆，最早發現載于《神農本草經》，用藥屬上品。中醫藥典籍《本草綱目》中稱：“耆，長也，色黃者黃耆，乃補藥之長”[1]。黃芪的功效有祛邪、扶正，歷來中醫當“補氣固表之圣藥“使用。黃芪藥材中所含化學成分主要有黃酮類、多糖類、皂苷類以及多種氨基酸等。現代醫學、藥理學、毒理學研究表明，黃芪具有降壓利尿、抗衰老、增強人機免疫力、降血糖、抗疲勞、抗腫瘤、鎮痛鎮靜、益智、抗病毒等作用。尤其近年來在現代藥理研究日趨成熟，黃芪新的功效及用途被源源不斷的發掘[2]。本研究旨在通過試驗，觀察黃芪藥材總提取液對D-半乳糖所致亞急性衰老模型大鼠的學習記憶、大腦中SOD活性、MDA及NO含量的影響，探討其抗衰老的作用機制，為黃芪進一步開發成為抗衰老的天然植物源性藥物及為黃芪藥材的全方位綜合質量評價提供可供參考的實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

挑選成年Wistar實驗大鼠80只，體質健康，雌雄分半，體重均為310±15g，由陜西師范大學生命科學學院實驗動物中心提供。合格證號：SCXK（陜）2012-006。分4籠飼養，室溫保持在18～25℃，空氣濕度保持在40°，大鼠生活環境通風良好，空氣新鮮，可自由活動、取食、飲水。

1.2 藥品與試劑

黃芪提取液：實驗用黃芪采自西北農林科技大學藥用植物園，經過廖國珍教授鑒定，取根部經自然干燥，取黃芪根干品500g，置5000ml圓底燒瓶中，加開水3000ml在105℃下持續回流提取1.5h，抽濾，所剩殘渣再次加水3000ml持續回流提取3次，每次1h，抽濾，合并所有濾液后濃縮，置真空干燥箱內烘干，所得黃芪藥材總水提取物（1.3g生藥/ml）備用[2]。試驗大鼠的灌胃體積采用0.4ml/20g的標準[3]。

六味地黃丸藥液的配制：采用北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠產品（批號：國藥準字Z19993068）；購于陜西省西安市 邑區秦渡鎮怡康藥店。將六味地黃丸5粒置研缽中研磨成細粉后加入超純水適量，配置成含六味地黃丸藥物濃度為0.165g/ml的混懸液，每周用前重新制備一次，在冰箱中4℃下保存，在使用前1h加熱至37℃備用。

D-半乳糖（D-gal）：由上海生工生物工程有限公司進口分裝；丙二醛（MDA）、超氧歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自南京市建成生物技術研究所（批號：20090726）。

2 方法

2.1 初步建立D-gal致亞急性大鼠衰老模型[4]

將雌雄各半的60只Wistar大鼠，隨機分為六組：（1）D-gal+黃芪提取液高劑量組；（2）D-gal+黃芪提取液中劑量組；（3）D-gal+黃芪提取液低劑量組；（4）D-gal+六味地黃丸藥物組；（5）D-gal空白組；（6）正常對照組。（1）、（2）、（3）、（4）、（5）五組采用D-gal致亞急性衰老法造成大鼠亞急性衰老模型。將D-gal 5000mg加于500ml生理鹽水中溶解，精確配制成濃度為10mg/ml的注射液，注射劑量設置為130mg/kg.d（即按大鼠每克體重注射0.0130ml D-gal注射液）在大鼠腹腔中部注射，（6）正常對照組使用等體積生理鹽水注射，6組大鼠采取每周稱重的方式，依據末次稱重的體重克數調整給藥劑量，連續造模8w。其中（1）D-gal+黃芪提取液高劑量組、（2）D-gal+黃芪提取液中劑量組、（3）D-gal+黃芪提取液低劑量組、（4）D-gal+六味地黃丸藥物組大鼠在第2周結束后分別灌胃給藥，規格為黃芪提取液0.5g/kg、0.25g/kg、0.1g/kg及六味地黃丸6.5mg/10g；（5）D-gal組大鼠以等量雙蒸水給藥；（6）正常對照組大鼠采用頸背部皮下注射的方式給予等量生理鹽水，并于第2周結束后給予等量雙蒸水，以此建立非模型常對照組。

2.2 學習記憶能力檢測-Y迷宮法[4]

將大鼠置于等方向輻射式反射箱（三向Y迷宮）。在大鼠被電擊后能快速逃跑至安全區規定為1次正確逃離反應，每連續進行10次測驗中若有9次（90%）逃離反應正確，則記錄為大鼠習得標準。記錄（6）正常對照組和（1）、（2）、（3）、（4）、（5）各試驗組中每只大鼠達到標準所需的試驗次數，用以統計學分析。

2.3 測定大鼠腦組織中的SOD的活性

將試驗結束后的大鼠迅速斷頭處死，獲取大腦組織并加入組織勻漿液在冰浴條件下勻漿，采用Bradfor D法準確測定大鼠腦組織中總蛋白的含量。取濃度為1%的大鼠腦組織勻漿液，在波長為545nm處選用黃嘌呤氧化酶法（ SOD檢測試劑盒）分別測定（6）正常對照組和（1）、（2）、（3）、（4）、（5）各試驗組大鼠腦組織勻漿液的吸光度ASOD。

2.4 測定腦組織中MDA的含量

試驗大鼠腦組織蛋白勻漿制備和定量方法均同2.3項下方法。于波長534nm處，用TBA比色法（MDA檢測試劑盒）分別測定對照組和各試驗組大鼠腦組織勻漿液的吸光度AMDA。

2.5 一氧化氮（NO）含量測定

（1）樣品的預處理。稱取100mg低溫凍存大腦皮質組織，放入體積為0.9ml濃度為0.9% 的NaCl的試管內，在電動勻漿器內運行3min，制備成濃度為10%的組織勻漿，然后在離心機內（3000r/min）離心15min，取上清液備用，采用硝酸還原酶法測定腦組織中NO的準確含量。

（2）配制試劑。試劑盒內7種試劑：試劑1、2在試驗前置于37℃水浴中充分溶解；試劑3、4、7保存在室溫（25± 2℃）下；試劑5在試驗前加入燒沸的雙蒸水20ml，充分溶解后在避光陰涼處保存；試劑6在試驗前加入常溫雙蒸水8ml，充分混合后冷藏，并在避光條件下保存；顯色劑的配制比例為試劑5：6：7=3：1：1，避光條件下存儲；標準應用液配制，取0.1ml標準品，采用雙蒸水稀釋后定容至15 ml，混勻，即得。

（3）操作方法

混勻，25℃條件下陰涼避光放置10分鐘后用雙蒸水調零，在波長545nm下采用1.0cm光徑，測定各組試劑的吸收度A。

根據以下公式計算腦組織中NO的含量。

2.6 統計學進行數據分析

采用SPSS 22.00版本統計分析軟件，比較正常對照組與各試驗組之間是否存在顯著差異。

3 結果

3.1 黃芪藥材總提液對D-gal致衰老模型大鼠的學習記憶能力的影響

試驗結果顯示，與正常對照組相比較，在D-gal造模6周以后，模型組的大鼠達到習得標準所需要的訓練次數呈現極顯著增加（P<0.01），而在黃芪總提取液中、高劑量組的大鼠達到習得標準所需要的訓練次數呈現出顯著低于模型組（P<0.05）的態勢。試驗結果見表2。

3.2 黃芪總提取液對D-gal所致衰老模型大鼠腦組織中SOD活性和MDA含量的影響

試驗結果顯示，與正常對照組相比較，在D-gal造模6周以后，模型組的大鼠腦組織中SOD的活性呈現出顯著降低的態勢（P<0.01），而腦組織中MDA的含量卻呈現出極顯著升高（P<0.01）的趨勢。在與模型組相比較的結果中顯示，黃芪總提取液中、高劑量均呈現出使大鼠腦組織中SOD活性顯著增加（P<0.05），而MDA的含量顯著降低（P<0.05）的趨勢。結果見表3。

3.3 黃芪提取液對D-gal致亞急性衰老大鼠腦組織NO的影響

表4的結果顯示：

（1）造模6周后，模型對照組與空白對照組相比，大鼠腦組織中NO的含量存在極顯著差異（P<0.01），各不同劑量給藥組與模型對照組比較，試驗結果呈現出顯著性差異（P<0.05）。

（2）各不同劑量給藥組與空白對照組相比較，各組均呈現出顯著性差異（P<0.05）。

（3）黃芪總提取液低、中、高各劑量組之間的藥效作用大體無差別，統計學顯示為無差異（P>0.05）。

以上結果提示我們，對于D-gal致衰老的大鼠腦組織中NO含量的升高，試驗設計的各不同劑量給藥組均起到了降低NO的作用，但尚未恢復至健康大鼠的正常水平。黃芪總提取液低、中、高各不同劑量組之間的藥效無顯著性差異，說明試驗設計方面的改進不需要再增加或減少劑量，而黃芪總提取液對NO含量的降低功效很可能是藥物發揮抗衰老機制的重要途徑之一。

4 討論

關于衰老的學說，學術界尚未達成共識，其中自由基致衰老學說的觀點認為新陳代謝是一切生命現象的本質和基礎，衰老是生命有機體發生代謝性障礙導致的結果。糖代謝的紊亂會誘發心、肝、腦、腎等臟器代謝異常，導致生命走向衰老[5]。據此理論，我們設計了動物衰老模型，即在一定的時間段內持續給試驗動物大鼠注射一定劑量的D-gal，使機體細胞內的D-gal濃度在規定時間內持續升高，最終D-gal在醛糖還原酶的作用下，生成還原產物半乳糖醇，半乳糖醇在細胞內不能被正常代謝而富集起來，使細胞滲透壓增加，體積發生膨脹，從而出現功能障礙、代謝紊亂的現象，此外，生命有機體還呈現出多種抗氧化酶活性下降，機體抗氧化能力降低，大量的活性氧、自由基產生，伴隨這一過程的現象還有細胞膜結構受損，過氧化脂質及脂褐素升高，最終導致機體衰老現象的發生。試驗表明，用D-gal注射建立亞急性衰老模型大鼠的學習記憶能力降低、活性氧和自由基產物增多、抗氧化降低、免疫力下降，可用于動物行為學、抗氧化能力以及免疫學等學說的抗衰老藥物效果研究。本實驗采用D-gal注射制備的亞急性衰老大鼠模型結果也顯示，D-gal造模后，大鼠的免疫器官開始萎縮，經過測量，血清總蛋白和白蛋白含量下降，腦組織中NO含量上升，充分證明造模大鼠的癥狀為免疫力明顯下降。

生物有機體在新陳代謝過程中會持續的產生多種具有強氧化能力的自由基和活性氧，當富集在細胞內的自由基數量超出機體自身的清除能力時，自由基會誘發一系列的的氧化還原反應，從而直接或間接導致細胞膜脂質受損以及新的交聯鍵的不斷產生，導致體內生物化學反應的酶活性降低、引起DNA鏈非正常斷裂、活性多糖被降解、導致機體正常代謝被破壞，表現為各種疾病，同時加速機體衰老，皮膚光澤度下降、老年斑、皺紋等體征開始出現，對機體造成極大的傷害。根據D-gal致衰老造模是根據衰老的代謝學說而制備的一種典型衰老模型，它具有的自由基代謝紊亂特征與自然衰老非常相似，在學術界認為該模型導致的衰老與自然衰老接近[5]。大量的D-gal進入體內后，發生氧化還原反應，生成具有強氧化性的自由基，自由基可引發脂質過氧化的鏈式反應，細胞膜上的過氧化脂質（LPO）的分解，產生的丙二醛（MDA）與DNA、RNA及蛋白質等物質結合，最終導致細胞膜組份發生變化、功能發生障礙，促進生命機體走向衰老[7]。除此之外，脂質過氧化的產物MDA還可引起機體精神行為變化，通過化學鍵交聯、結合生成脂褐質，誘發神經系統發生功能障礙。近年來，多項研究結果顯示[6]，腦組織中MDA的含量隨年齡的增加而上升，SOD活性隨年齡的增長而下降。SOD在機體代謝中的重要性體現在對保護機體心腦功能、延緩衰老方面具有不可忽視的作用。機體內SOD的活性與生命的長度呈現正相關[8]。

本研究結果顯示，經D-gal注射造模后的大鼠學習記憶力顯著降低、腦組織中SOD活性顯著下降，MDA含量顯著增高，表現出明顯的生命衰老體征；造模前后對比，D-gal致衰老模型的大鼠腦組織中NO含量顯著高于空白對照組的含量，黃芪總提取物低、中、高不同劑量對NO含量有一定程度的降低作用，但各劑量組之間的差異無統計學意義，初步正面黃芪總提取物很有可能是通過抑制組織內NO的升高而產生增強生命機體免疫力的功效。

本研究結果表明，黃芪總提取液可導致D-gal 致衰老模型大鼠的衰老指征發生改變，學習記憶能力提高，SOD活性升高，MDA、NO含量降低。綜上，黃芪總提取液具有延緩生命機體衰老的功效，可為開發防神經退行性病變、抗機體衰老的植物源性藥物提供一定的參考。

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