豬圓環病毒3型的快速、可視環介導等溫檢測技術開發研究

摘譯自Park等. Journal of Virological Methods (2018) 253:26﹣30梁海英，張愛瓊，曾智勇(編譯)

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

曾智勇，男，1978年9月生，四川威遠人，博士，貴州大學教授、碩士研究生導師、貴州大學學術骨干，貴州省科技特派員，黑龍江畜牧獸醫雜志編委。主要從事動物傳染病及病原分子生物學相關研究，以規模化豬場主要病毒性疫病為基礎，開展新型疫苗和病原快速檢測方法及試劑盒的研發。同時，長期面向豬場開展豬病毒性疫病的抗體監測和病原的快速檢測以及規模化豬場疾病防控指導，為豬場提供技術支持。

主持國家自然科學基金項目1項，省廳級項目3項；參研貴州省農業科技攻關項目5項，其他各類省廳(局)級項目13項；獲“貴州省科學技術進步獎三等獎”3項。先后發表各類學術論文180余篇，其中SCI論文3篇，一級學報論文12篇，核心期刊90余篇；參編養殖技術叢書3冊，參編專業類著作2冊，參編《畜牧獸醫行政管理學》（國家規劃教材）。

圓環病毒（PCV）是圓環病毒科圓環病毒屬的一種無囊膜的單股環狀DNA病毒。目前報道的基因型有3種：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1最早于1974年被發現，被認為是傳代培養細胞PK-15的永久性污染物，對豬不具有致病作用，但在很多國家的豬體內普遍存在；PCV2則認為引起豬圓環病毒相關疾病（PCVAD）的主要病原，其中以斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）為代表，包括母豬繁殖障礙、豬皮炎和腎病（PDNS）、呼吸系統疾病等；2016年，Plan和Palinski等幾乎同一時間報道了一種與豬皮炎和腎病綜合征、生殖功能障礙和多系統炎癥相關的新型圓環病毒（PCV3）。隨后，中國、韓國和波蘭在患有呼吸系統疾病、PDNS和生殖系統疾病的豬中也檢測出了PCV3。這些報道表明，PCV3在美國，中國，韓國和波蘭的豬群中均有流行。鑒于PCV3的廣泛流行，Park等開發了一種用于PCV3檢測的快速、可視環介導等溫技術（LAMP），并用臨床PCV3陽性樣品對其檢測效果進行測定評估。

快速、可視環介導等溫技術（LAMP）的開發是通過使用在線引物設計軟件Primer Explorer version 4（http：//www．primerexplorer．jp/e/）設計靶向PCV3 Cap保守區域的6個引物（2個內部，2個外部和2個環狀引物），序列如下：

F3，5'-AAGCAGTGCTCCCCATTG-3'；B3，5'-TGGACCACAAACACTTGGC-3'；FIP，5'-GCTCACCCAGGACAAAGCCTA ACGGTGGGGTCATATGTGT-3'；BIP，5'-TGGTTTGGGGGTGAAGTAACGGC AAGACGACCCTTATGCGGA-3'；LF，5'-TCTCCAGACCCACCCCATG3'；和LB，5'-GAAGTCATAACTTTACGAGTGGAAC-3'。設計反應體系（25 μ L）如下：20mM T ris-HCl（pH8．8），10 mM KCl，10 mM（NH4）2SO4，0．1% Triton X-100，8U Bst DNA聚合酶，0．12μM羥基萘酚藍，1．6μM內引物（FIP和BIP），0．2μM外引物（F3和B3），0．8μM環狀引物（LF和LB），1．4 mM dNTP，8mM MgSO4，0．8 mM 甘氨酸三甲胺內鹽，5μL模板DNA，最后用dH2O補足25 μL。通過設計53 ℃至66 ℃范圍內的梯度溫度以及30 min至60 min的反應時間來優化反應條件，最后以80 ℃ 5 min來終止反應，所有實驗重復3次。由于存在金屬離子指示劑HNB，可觀察到檢測反應管中從紫色到天藍色的顏色變化（在LAMP對陽性核酸擴增過程中，產生大量不溶性焦磷酸鎂，導致反應溶液中的Mg2+濃度顯著降低，這導致HNB溶液的顏色從紫色變為藍色）。最終通過顏色變化和1．5%瓊脂糖凝膠電泳后條帶效果，確定62°C為最佳反應溫度。隨后，在不同反應時間（30～60min），用3種稀釋度的PCV3核酸（5×104，5×103和5×102拷貝/反應）進行LAMP，確實最佳反應時間為40 min，在該反應時間完成的擴增中，可以觀察到以102個拷貝為模板的反應中有明顯條帶。為測試LAMP檢測技術的特異性，使用PCV1（陽性PK-15細胞培養物），PCV2（PCK0201菌株），PCV3，1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV，Lelystad病毒），2型PRRSV（LMY毒株），豬瘟病毒（CSFV，LOM毒株）和豬細小病毒（PPV，NADL-2毒株）進行實驗，并用未感染PCV3的兩種豬源細胞培養物（ST細胞和PK-15細胞）作為陰性對照。如預期的測定結果一樣，反應終止后在含有PCV3 DNA樣品的反應管中觀察到天藍色，而含有其他病毒、病毒細胞培養物以及陰性對照中保持紫色（即沒有顏色變化）。通過凝膠電泳觀察只有含有PCV3 DNA模板的反應才能獲得典型的梯狀條帶。這些結果表明PCV3 LAMP測定法可以特異性檢測PCV3，并且不顯示與其他病毒病原體的交叉反應性。

圖1 LAMP，PCR和qPCR對PCV3檢測的靈敏度比較A：LAMP擴增電泳圖；B：LAMP擴增可視化；C：PCR擴增電泳圖；D：qPCR測定的擴增曲線；編號1-7：PCV3 擴增產物（1-7：5×106-5×100拷貝）；M：100bp梯度Maker NC：陰性對照

表1 LAMP，PCR和qPCR對78個臨床豬樣品進行PCV3檢測比較

Park等使用10倍稀釋法將PCV3標準樣品從 5×106至 5×100拷貝進行稀釋，來評估LAMP測定的檢測限（LOD），并與Ku建立的PCR和Palinsk建立的qPCR進行比較分析。結果顯示LAMP測定的LOD為5×101個 拷 貝（ 圖1A、1B）， 而PCR和qPCR測定的LOD分別為5×102個拷貝（圖1C）和5×101個拷貝（圖1D）。這些發現表明，LAMP分析的靈敏度與qPCR相似，比常規PCR高10倍。

對于LAMP測定的臨床評估，在2017年Palinski等確定PCV3為陽性的豬場中收集78個臨床樣品（17個胎兒組織，29個消瘦仔豬組織和32個消瘦仔豬血清樣品），使用LAMP技術與上述的PCR和qPCR檢測技術進行檢測比較分析。結果發現LAMP檢測 PCV3陽性率為 42．3%（33/78），與qPCR相同，并且高于常規PCR的 26．9%（21/78），見表 1。且通過qPCR檢測為PCV3陽性的組織和血清樣品經LAMP檢測證實均為陽性。在特異性、靈敏度和整體一致性方面LAMP測定結果與qPCR測定100%一致（表1）。這些結果表明LAMP測定是高度特異和敏感的，并且可以替代常規PCR和qPCR用于檢測臨床樣品中的PCV3。

與傳統PCR的測定相比，Park等建立的PCV3 LAMP檢測技術具有快速、可視、高特異性和高靈敏性等優點，可能將成為臨床樣品中PCV3快速、特異性診斷以及流行病學調查的有用工具。