超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜法同時測定不同貯藏條件下紅參中17種人參皂苷類成分

石婧婧，陳舒妤，鄒立思，劉訓(xùn)紅*，唐仁茂，馬繼梅，嚴(yán) 穎，趙 慧

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇 泰州 225500)

紅參是我國名貴中藥材之一，系五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖，具有大補元氣、復(fù)脈固脫、益氣攝血的功效，用于治療體虛欲脫、肢冷脈微、氣不攝血、崩漏下血等癥[1]。現(xiàn)代研究表明，紅參的主要藥效成分為人參皂苷類，具有抗肝毒活性、抗糖尿病、抗衰老、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等藥理作用[2]。中藥療效的發(fā)揮是多種活性成分綜合作用的結(jié)果，針對紅參多種藥效成分的特點，建立多種藥效成分同時測定的方法，對探討多指標(biāo)成分的綜合評價體系具有實用性和有效性。

藥材的品質(zhì)受種質(zhì)資源、生態(tài)環(huán)境、采收加工、貯藏保管等因素的影響，其中貯藏保管是藥材品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)。關(guān)于紅參的品質(zhì)形成研究，種質(zhì)資源、生態(tài)環(huán)境和藥材采收等方面的研究較成熟，且普遍得到公認(rèn)，以上研究多集中于加工對紅參品質(zhì)的影響[3-4]，貯藏條件對商品藥材品質(zhì)變化的影響常被忽略。科學(xué)的貯藏方法可以減少藥材存放過程中由于自身特點及貯藏環(huán)境因素對其質(zhì)量產(chǎn)生的不良影響，確保臨床用藥的療效[5-7]。紅參的質(zhì)量評價多以含量較高的幾種人參皂苷為指標(biāo)[8-11]，尚少見基于多種人參皂苷同時測定考察與評價紅參藥材貯藏的研究報道[12]。本實驗基于超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)技術(shù)，建立了同時測定紅參中原人參二醇型皂苷(人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、CK)、原人參三醇型皂苷(人參皂苷Re、Rg1、Rf、20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rg2、20(R)-Rh1、F1)、齊墩果烷型皂苷(人參皂苷Ro)17種指標(biāo)成分含量的方法，并結(jié)合主成分分析(PCA)和聚類分析法(HCA)對不同貯藏(不同包裝材料和貯藏溫度)條件下的紅參藥材進行比較與綜合評價，旨在為紅參貯藏方法和條件的優(yōu)選提供基礎(chǔ)資料，同時為紅參藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和全面控制提供新的方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：Shimadzu SIL-20A XR 超快速液相色譜儀(日本島津公司)包括LC-20AD二元輸液泵、STL-20A XR 自動進樣器。CTO-20AC柱溫箱；AB QTRAP 5500 三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB Sciex 公司)，配有電噴霧離子源及Analyst 1.5.2軟件。KQ-500B超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz)；BSA2245型電子分析天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；ME36S型電子分析天平(百萬分之一，德國賽多利斯公司)；H1650-W高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪儀器廠)；Q-500B高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)。

人參皂苷Rb1(Rb1，批號：16060402)、人參皂苷Rc(Rc，批號：15121701)、人參皂苷20(R)-Rg3(20(R)-Rg3，批號：15121701)、人參皂苷Rd(Rd，批號：16051604)、人參皂苷Rf(Rf，批號：16052502)、人參皂苷CK(CK，批號：16072902)、人參皂苷20(S)-Rg2(20(S)-Rg2，批號：15123004)、人參皂苷20(S)-Rh1(20(S)-Rh1，批號：16081802)、人參皂苷Re(Re，批號：16081605)、人參皂苷F2(F2，批號：16081105)、人參皂苷Rg1(Rg1，批號：15121303)、人參皂苷Rb2(Rb2，批號：16061503)、人參皂苷Ro(Ro，批號：16050405)、人參皂苷20(R)-Rh1(20(R)-Rh1，批號：15121903)、人參皂苷20(S)-Rg3(20(S)-Rg3，批號：16012405)、人參皂苷20(R)-Rg2(20(R)-Rg2，批號：17022103)、人參皂苷F1(F1，批號：16081205)經(jīng)HPLC測定純度均大于98%，購自南京良緯生物科技有限公司。實驗用水為超純水；乙腈、乙醇、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

表1 不同貯藏條件的樣品信息Table 1 Information of samples under different storage conditions

實驗樣品(人參)采自吉林省長白市靖宇縣人參規(guī)范種植基地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的根及根莖，按產(chǎn)地的傳統(tǒng)加工方法加工成紅參藥材。通過產(chǎn)地和市場調(diào)研，結(jié)合實際設(shè)計貯藏考察方法，各取紅參藥材500 g，按不同貯藏條件(包裝材料及貯藏溫度)避光貯藏半年后取出，樣品信息見表1。留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實驗室。

1.2 溶液制備

1.2.1對照品溶液的制備分別稱取人參皂苷Re、Rg1、Rf、20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、20(S)-Rh1、Rb1、20(R)-Rh1、Rc、Ro、Rb2、F1、Rd、F2、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3和CK對照品適量，精密稱定，加60%乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為956、992、1 036、1 004、966、988、922、954、948、974、1 042、1 010、996、952、1 070、1 056、980 mg/L的對照品母液；取適量的各對照品母液，加甲醇配制成含上述對照品的混合儲備液，并逐級稀釋，得到一系列的混合對照品溶液，于4 ℃保存，備用。

1.2.2供試品溶液的制備取干燥至恒重的樣品粉碎，過60目篩，精密稱定0.5 g樣品粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL 60%乙醇，于室溫下超聲(500 W、40 kHz)提取2 h后取出，放至室溫以60%乙醇補足失重，靜置冷卻，4 ℃保存，12 000 r/min離心10 min，取上清液過 0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件色譜柱：SynergiTMHydro-RP 100 ?柱(100 mm×2.0 mm，2.5 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫：0～0.01 min，10%B；0.01～2.0 min，10%～25%B；2.0～11.0 min，25%B；11.0～13.5 min，25%～45%B；13.5～15.5 min，45%B；15.5～16.5 min，45%～98%B；16.5～18.0 min，98%～10%B；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量2 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件使用AB Sciex QTRAP 5500 三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀在電噴霧負(fù)離子(ESI-)模式下進行多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測，氣簾氣(CUR)壓力為241.4 kPa，霧化氣(Gas1)壓力為379.3 kPa，輔助氣(Gas2)壓力為379.3 kPa，溫度(TEM)為550 ℃，噴霧電壓為5 500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考察了水-甲醇、水-乙腈和0.1%甲酸水-乙腈作為流動相時的分離效果。結(jié)果表明，乙腈作為流動相時的分離效果明顯優(yōu)于甲醇，在流動相中加入一定量的甲酸可以減少色譜峰的拖尾，提高分離效果和檢測靈敏度。因此，本實驗最終采用0.1%甲酸水-乙腈作為流動相。

采用正、負(fù)兩種離子模式測定17種化學(xué)成分的含量，經(jīng)過反復(fù)試驗，發(fā)現(xiàn)各成分在負(fù)離子模式下檢測具有較高的穩(wěn)定性、較高的響應(yīng)值和較好的峰形，因此選擇負(fù)離子模式檢測。17種人參皂苷類成分的具體質(zhì)譜參數(shù)及其MRM色譜圖見表2及圖1。

表2 17種目標(biāo)成分的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 MS/MS parameters of seventeen components

(續(xù)表2)

No.CompoundMolecular formulatR/minMass data(m/z)DP/VCE/eV7Ginsenoside Rb1(Rb1)C54H92O2313.311 107.6/945.7-20-588Ginsenoside 20(R)-Rh1(20(R)-Rh1)C36H62O913.53683.6/475.3-20-359Ginsenoside Rc(Rc)C53H90O2213.661 077.6/945.7-20-5810Ginsenoside Ro(Ro)C48H76O1913.69955.6/793.4-5-6011Ginsenoside Rb2(Rb2)C53H90O2213.891 077.6/945.5-100-5512Ginsenoside F1(F1)C36H62O914.07683.4/475.3-20-3013Ginsenoside Rd(Rd)C48H82O1814.23991.7/783.4-120-5514Ginsenoside F2(F2)C42H72O1315.27829.6/621.4-20-3515Ginsenoside 20(S)-Rg3(20(S)-Rg3)C42H72O1315.85783.5/59.1-10-10616Ginsenoside 20(R)-Rg3(20(R)-Rg3)C53H90O2216.00829.6/621.4-20-4517Ginsenoside CK(CK)C36H62O817.75667.4/459.3-20-30

圖1 17種目標(biāo)成分的混合對照品的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of seventeen components in reference substancesthe peak numbers(1-17) denoted were the same as those in Table 1

2.2 供試品制備方法的優(yōu)化

實驗對提取溶劑(60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇)、料液比(1∶20、1∶30、1∶50)及提取時間(1、1.5、2 h)進行正交實驗考察，以人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1的含量總和為指標(biāo)。結(jié)果表明，最佳提取溶劑為60%乙醇，料液比為1∶50，提取時間為2 h。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系、檢出限與定量下限精密吸取“1.2.1”中不同濃度系列的對照品溶液及混合對照品儲備液各2 μL，按“1.3”色譜、質(zhì)譜條件進行測定，以對照品的峰面積(Y)對相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X，μg/L)進行線性回歸，線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍結(jié)果見表3。17種人參皂苷類成分均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999 0。以信噪比(S/N)約為3計算各成分的檢出限(LOD)，以S/N≈10計算各成分的定量下限(LOQ)，結(jié)果見表3。17種人參皂苷類成分的LOD為0.73～27.81 μg/L，LOQ為3.87～84.12 μg/L。

表3 17種化合物的線性關(guān)系、檢出限和定量下限Table 3 Linear relations，LODs and LOQs of seventeen components

2.3.2精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗精密吸取一定濃度的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定各對照品峰面積，計算得17種目標(biāo)成分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.77%～2.6%(表4)，說明儀器精密度良好；稱取同一紅參樣品6份，每份0.5 g，精密稱定，分別按“1.2.2”制備供試液，進樣測定，計算得17種目標(biāo)成分含量的RSD為1.2%～2.4%(表4)，表明該方法重復(fù)性良好；取同一紅參樣品供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣分析，測定峰面積，計算得17種目標(biāo)成分峰面積的RSD為1.0%～3.8%(表4)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.3.3加標(biāo)回收率試驗精密稱取已知含量的紅參樣品0.25 g(9份)，精密稱定，分別加入低、中、高3個質(zhì)量濃度的對照品溶液(分別相當(dāng)于樣品中各對照品含量為50%、100%、150%)，每個濃度平行制備3份，按“1.2.2”制備加標(biāo)回收供試品溶液并進行測定，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(表4)。17種人參皂苷類成分的平均回收率為96.4%～103%，RSD為0.68%～4.3%。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可以滿足日常樣品的分析要求。

表4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率結(jié)果Table 4 Precision，repeatability，stability and recovery of the method

2.4 樣品含量的測定

取供試品溶液2 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，按照優(yōu)化條件進行測定，根據(jù)相應(yīng)的線性關(guān)系計算供試樣品中17種目標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，不同貯藏條件下紅參樣品中17種人參皂苷類成分差異明顯，其中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量較高，分別為6 983.81～11 538.24、3 801.15～6 093.83、7 937.33～10 492.05 μg/g。從17種人參皂苷總量來看，以紙箱為包裝，貯藏于-20 ℃條件下的紅參樣品(S4)總含量最高，達(dá)到53 835.10 μg/g；以牛皮紙袋為包裝，貯藏于陰涼庫(<20 ℃)條件下的紅參樣品(S8)總含量最低，僅4 4603.17 μg/g。由此可見，不同的貯藏條件會影響紅參藥材中人參皂苷類成分的含量。

表5 不同貯藏條件下紅參樣品的測定結(jié)果(μg/g，n=3)Table 5 Contents of samples under different storage conditions(μg/g，n=3)

(續(xù)表5)

CompoundS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10Rd8 151.286 535.777 128.528 644.655 750.687 213.667 458.555 755.286 053.376 380.15F234.8436.9823.5927.1623.7720.0120.3911.6420.2114.1120(S)-Rg3887.241 683.64232.30984.501 056.85989.841 259.321 168.811 460.181 331.6320(R)-Rg32 207.311 622.232 165.322 410.291 789.931 942.932 164.021 777.512 095.651 761.19CK17.4310.9320.5616.1222.5021.1421.0921.0520.7521.36Sum47 833.4548 151.1846 493.1853 835.1044 766.0349 106.2746 988.6644 603.1746 157.9245 024.72

圖2 不同貯藏條件下紅參樣品的聚類分析譜系圖Fig.2 Dendrogram of Ginseng Radix et Rhizoma Rubra under different storage conditions

2.5 聚類分析

根據(jù)不同貯藏條件紅參樣品中各目標(biāo)成分含量的測定結(jié)果，用聚類分析中的 Ward 法，利用 SPSS 中的 Hierarchical Cluster分析，對10個樣品進行聚類分析。聚類的原則是相近的聚為一類，即距離最近或最相似的聚為一類，距離值越小，個體或變量之間越相近[18]。當(dāng)臨界值為20～25時可將不同貯藏方法的紅參樣品分為2類，S1、S4聚為一類，其他樣品聚為一類(圖2)，結(jié)果表明不同貯藏條件下紅參樣品的質(zhì)量存在一定差異。

2.6 主成分分析

主成分分析是一種降維或?qū)⒍鄠€指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標(biāo)的方法，有利于克服單一指標(biāo)的局限性，通過綜合多種指標(biāo)來準(zhǔn)確、可靠地評判藥材品質(zhì)[13-14]，對于紅參質(zhì)量的綜合評價具有重要意義。

本文以人參皂苷類成分為指標(biāo)，對不同貯藏條件下紅參藥材中17種指標(biāo)成分進行主成分分析。通過SPSS 16.0計算主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率，結(jié)果如下：第一主成分的特征值為5.406，方差貢獻(xiàn)率為31.801%；第二主成分的特征值為3.228，方差貢獻(xiàn)率為18.991%；第三主成分的特征值為2.793，方差貢獻(xiàn)率為16.431%；第四主成分的特征值為1.947，方差貢獻(xiàn)率為11.450%；第五主成分的特征值為1.531，方差貢獻(xiàn)率為9.007%；其他主成分特征值的貢獻(xiàn)率依次減少。前5個主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)87.681%，且特征值均大于1，滿足主成分的選取要求[15]，表明前5個主成分可以反映17種人參皂苷的綜合質(zhì)量。

每個主成分均為原始變量的線性組合，線性組合中各變量對主成分的影響用載荷表示，載荷絕對值越大，其影響越大[16]，在主成分分析中，一般認(rèn)為大于0.30，表明載荷顯著[17]。不同貯藏條件下17種人參皂苷的載荷如表6所示，在第一主成分中，人參皂苷20(S)-Rh1和Rd的因子載荷量最大，說明第一主成分主要反映了人參皂苷20(S)-Rh1、Rd的信息；同理，第二主成分主要反映了人參皂苷Ro、CK的信息；第三主成分主要反映了人參皂苷Re、20(S)-Rg2的信息；第四主成分主要反映了人參皂苷Rc、Rb1的信息；第五主成分主要反映了人參皂苷Rb2、20(R)-Rg2的信息。前5個主成分基本包含了大部分成分的信息。

表6 初始因子載荷矩陣Table 6 Component matrix

(續(xù)表6)

CompoundPrincipal component12345Rc0.1250.2610.1410.8990.166Ro-0.5310.7230.276-0.0060.331Rb20.255-0.1290.1790.193-0.835F10.593-0.5780.326-0.247-0.237Rd0.8440.2900.2170.0910.105F20.687-0.6520.0900.185-0.04520(S)-Rg3-0.469-0.5720.2230.1110.34920(R)-Rg30.7500.492-0.0200.040-0.093CK-0.4270.635-0.545-0.122-0.204

2.7 綜合評價

不同貯藏條件下紅參樣品的主成分各因子總得分見表7，可根據(jù)權(quán)重系數(shù)計算得出各樣品的綜合得分。權(quán)重系數(shù)的計算依據(jù)其方差貢獻(xiàn)的大小，即各主成分的貢獻(xiàn)率與5個主成分的總貢獻(xiàn)率之比，第一主成分的權(quán)重為31.801%/87.681%=0.362 7，同理可得第二、三、四、五的權(quán)重為0.216 7、0.187 4、0.130 6、0.102 7。各主成分的因子得分與其權(quán)重乘積之和相加，得出各紅參樣品的總因子得分F，得分越高，表明質(zhì)量越好[18]。由表7可知，以紙箱為包裝，貯藏于-20 ℃和常溫條件下的紅參樣品(S4、S1)綜合得分較高，說明這兩種貯藏條件下的紅參樣品整體質(zhì)量較好。以紙箱為包裝，貯藏于-40 ℃下的紅參樣品(S5)綜合質(zhì)量較差。-20 ℃與-40 ℃均為冷凍貯藏，但-20 ℃為緩凍，-40 ℃為速凍，兩者的冰凍速度有差異，這有可能是-20 ℃與-40 ℃貯藏條件下的紅參樣品質(zhì)量相差較大的原因[19]。

聚類分析結(jié)果表明，以紙箱為包裝，貯藏于-20 ℃和常溫條件下的紅參樣品(S4、 S1)聚為一類，說明這兩個樣品之間的相似性較高。綜合評價得分結(jié)果表明，以紙箱為包裝，貯藏于-20 ℃和常溫條件下的紅參樣品(S4、 S1)整體質(zhì)量較好。但本文只考察了半年的貯藏期，若貯藏期更長，常溫貯藏下的紅參樣品可能會出現(xiàn)蟲蛀、發(fā)霉等現(xiàn)象[20]，所以在短期貯藏中，考慮以紙箱為包裝，存放于-20 ℃或常溫條件下；但需要長期貯藏時，以紙箱為包裝，存放于-20 ℃條件下較為合適，這與已有文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[21]。

表7 不同貯藏條件紅參主成分的得分和綜合得分Table 7 Component scores and comprehensive scores of samples

3 結(jié) 論

本文建立了UFLC-QTRAP-MS/MS法同時測定紅參中人參皂苷Rb1、Rc 、Rb2、Rd、F2、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、CK、Re、Rg1、Rf、20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rg2、20(R)-Rh1、F1、Ro 17種指標(biāo)成分含量的方法，并結(jié)合主成分分析和聚類分析法對不同貯藏條件下紅參藥材進行比較分析與綜合評價。本研究可為紅參適宜貯藏條件的優(yōu)選提供基礎(chǔ)資料，同時為紅參藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和全面控制提供新的方法參考。