CRISPR基因編輯技術發展與應用前景

陳亦兒

摘 要：基因編輯技術是用于編輯改造生物DNA的技術。本文主要介紹的是目前最常用的CRISPR技術。該技術改造于細菌及古細菌防止外源DNA入侵的特異性免疫系統，其中Cas9型最為簡便實用。隨著CRISPR技術的逐漸完善，其高效、簡便、快捷的優點使其在基礎研究，臨床醫學，農業生產中都得到了廣泛應用。只要能正確合理的利用，CRISPR將極大地推動生命科學的發展與進步。

關鍵詞：CRISPR；基因編輯；醫學研究；農業生產

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）20-0189-02

1 CRISPR基因編輯技術

基因編輯技術是用于編輯改造生物DNA的技術。目前ZFN（zinc-finger nucleases，鋅指核酸酶）技術、TALEN （transcription activator-like effector nucleases，轉錄激活樣效應因子核酸酶）技術和CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，成簇規律間隔短回文重復）技術并稱為三大基因編輯技術。其中，新興的CRISPR技術相較TALEN技術和ZFN技術更簡易、更靈活、更高效，成本也更低，被認為是目前最有發展前景的基因編輯技術。

1987年Nakata研究組發現在位于IAP基因的3端存在堿基高度同源序列重復出現，引起生物科學界的廣泛關注。不久后，Jansen實驗室發現這種新型的DNA序列僅存在于細菌及古細菌中，并將這種序列稱為成簇規律間隔短回文重復，即CRISPR。他們將臨近CRISPR位點的基因命名為CAS（CRISPR-associated）基因。2012年，科學家們通過體外實驗證明了成熟的crRNA（CRISPR-derived RNA）指導CAS9蛋白在目標DNA上引起雙鏈斷裂。2013年，CRISPR/Cas系統逐步應用在基因編輯中。

2 CRISPR/Cas9系統原理

CRISPR/Cas系統主要由兩個部分組成：執行識別功能的前導序列與CRISPR簇，和執行切割整合功能的Cas蛋白。CRISPR-Cas系統對外來DNA序列進行識別主要依靠CRISPR基因片段。CRISPR序列通常由21bp-48bp較短的、保守的重復序列（repeats）組成，其序列由兩個間隔序列（spacer）隔開。在不同物種中，因為發揮作用的方式不盡相同，CRISPR系統被分為三類：TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ。

目前最常用的基因敲除技術——CRISPR/Cas9屬于TypeⅡ。Cas9基因編碼的Cas9蛋白是一種非特異性CRISPR結合核酸內切酶，該蛋白具有核酸酶的兩個結構域，因此可以分別切割DNA的兩條單鏈。當外源DNA侵入細胞時，前導序列會作為啟動子引導CRISPR序列轉錄出兩種RNA：pre-crRNA（pre-CRISPR-derived RNA）和tracrRNA（trans-acting crRNA）。tracrRNA由重復序列轉錄而成，具有發卡結構，而pre-crRNA則由整個CRISPR序列轉錄而成的大型RNA分子。tracrRNA通過堿基互補配對與pre-crRNA的重復序列部分結合，而后Cas9蛋白與tracrRNA結合形成Cas9/tracrRNA/crRNA復合物。該復合物將掃描整個外源DNA，識別與crRNA堿基互補的原間隔序列，而后crRNA就會與原間隔序列DNA的一條單鏈以堿基互補配對的方式雜交，形成R環。這時，Cas9蛋白的RuvC限制酶將剪切外源DNA分子未與crRNA結合的非互補鏈，而其HNH酶將剪切crRNA的互補鏈。這樣，外源DNA雙鏈斷裂，目的基因就會被敲除。如圖1所示。

3 CRISPR技術優勢

CRISPR技術在近年來突飛猛進，與較早的兩項基因編輯技術相比，CRISPR技術相對簡單、構建速度快，成本更低。

相比于ZFN技術，CRISPR技術更加高效。ZFN在對豬的Ppar-γ基因的打靶活性只有4%，對GGTA1基因的打靶效率僅為1%，而對IL2RG 基因的更低，僅為0.5%。以此可以看出，ZFN技術的打靶效率相對較低。而利用CRISPR技術對豬的vWF基因進行基因敲除，單等位基因的敲除效率高達68%，雙等位基因的敲除效率也達到37%。對豬的其他基因，例如BMP15基因，基因敲除效率也可達到20%以上。同時，CRISPR/Cas9與ZFN造成的基因突變作用效果相似。雖然TALEN技術和CRISPR/Cas技術在設計原理上都相對簡單，但相比于TALEN技術，CRISPR技術更加簡便、快捷，這主要體現在體系構建過程中。在構建過程中，TALEN體系大約需要20個重復序列通過分子克隆或TALE重復組裝方法定向連接，載體構型龐大，操作繁瑣。而CRISPR體系的Cas9蛋白和gRNA骨架對于任何靶基因的操作都可以共享，針對特定基因只需要在現有體系基礎上變動20或30個堿基的向導序列即可實現，且容易合成獲得。盡管TALEN技術的特異性略高于CRISPR技術，但通過在選擇CRISPR/Cas9切割位點時對全基因組序列進行全面的分析，可降低脫靶效率。

4 CRISPR技術應用

隨著CRISPR技術的逐漸完善，與CRISPR技術有關的實際應用也在不斷發展。

醫學研究方面，以CRISPR/Cas9技術為基礎建立的基因編輯模式已經非常成熟。例如利用Cas9基因敲入技術得到的患肺腺癌小鼠模型，該模型能夠體現多基因共同作用對肺癌表型的影響，更準確地反應癌癥發生的機制和疾病的表型，在生物學和疾病建模中得到廣泛應用；通過培育酪氨酸酶基因敲除型豬和PARK2、PINK1雙基因敲除型豬建立的人類白化病和帕金森綜合癥兩種豬模型，為人類異種器官移植的研究起到了推動作用。在病毒感染疾病治療中，利用CRISPR技術將HIV病毒的主要攻擊對象——人體免疫T細胞上的HIV-1病毒移除，能夠使HIV無法進一步感染其他細胞，這使根治艾滋病成為可能。在治療遺傳性疾病的應用中，利用CRISPR系統去除一個可引起眼睛中感光細胞缺失的基因突變，或可以治療視網膜色素變性，以恢復遺傳性視網膜色素變性患者的視力。

農業生產方面，CRISPR技術用于建立作物調控體系，增強農作物的產量。利用CRISPR/Cas9技術對粳稻zhonghua11的Gn1a、DEP1、GS3、IPA1這4個與產量相關的基因進行定點編輯，4個基因的突變效率分別為42.5%、67.5%、57.5%和27.5%，總體突變效率較高。并且第二代中Gn1、DEP1和GS3基因發生突變的水稻植株分別提高了穗粒數、密穗數和千粒重，增加了該水稻品種的產量。此外，CRISPR技術在增強家畜抗病方面發揮了巨大的作用。CD163基因被認為是豬藍耳病病毒的受體基因，CD1D是一類抗原呈遞因子。利用CRISPR/Cas9技術分別敲除豬的這兩個基因，獲得其基因編輯型豬。后續研究表明，該種基因編輯豬在接受藍耳病毒株后未表現出明顯的臨床癥狀，能夠有效地抵抗藍耳病病毒感染，而7頭對照豬全部表現出典型的藍耳病臨床癥狀。藍耳病是養豬業在全球范圍內危害性最高的傳染病之一，通過敲除CD163和CD1D基因獲得基因突變豬種，能夠有效地減少藍耳病造成的巨大經濟損失。

5 總結與展望

CRISPR/Cas9技術簡便、易操作、效率高、成本低，自問世以來就有著廣大應用前景。通過CRISPR技術，能夠更簡易地編輯基因，從而獲得具有目的性狀的生物。在醫學方面，CRISPR技術或能有效地治療遺傳病，如將患病胚胎的部分胚胎干細胞取出進行基因編輯，移除感病基因，再將基因編輯細胞注射回胎兒的囊胚腔中進行治療。將CRISPR技術應用于編輯經濟生物的基因，使生物產品增產，能夠增加社會經濟效益。因此，充分發揮CRISPR技術的積極作用，將給人類的生產生活帶來福音。

而美中不足的是，CRISPR系統存在一定的脫靶概率，操作過程中可能發生編輯錯誤。若在基因治療時發生難以立即察覺的編輯錯誤，將有可能對患者的健康甚至生命造成威脅。為降低靶效應帶來的不良影響，目前采用誘導Cas9蛋白的HNH核酸酶結構域失活，形成切割單鏈的Cas9蛋白的方法。另一方面，由于CRISPR技術編輯功能過于強大，若不加節制的開發使用，或將引發倫理，社會安全等嚴重問題。對此應建全相關法律體系，限制CRISPR技術的濫用，引導該技術向正確的方向發展。

CRISPR技術有著其它基因編輯技術難以替代的優點。若正確地利用CRISPR技術，不斷對其進行改造使之更加簡易可控，將會極其有效地推動生命科學和醫學等領域的發展和進步。

參考文獻

[1]吳金青，梅瑰等.應用SSA報告載體提高ZFN和CRISPR/Cas9對豬IGF2基因的打靶效率[J].遺傳，2015，37（01）：55-62.

[2]姜澤群，楊燁.CRISPR/Cas技術在生物醫藥研究中的應用[J].藥物生物技術，2016，23（05）：412-416.

[3]唐秀英，王會民等.CRISPR/Cas9系統在水稻基因組編輯中的應用[J].分子植物育種，2017，15（03）：895-902.

[4]幸宇云，楊強，任軍.CRISPR/Cas9基因組編輯技術在農業動物中的應用[J].遺傳，2016，38（03）：217-226.