地西他濱聯(lián)合三氧化二砷對肝癌SMMC-7721細(xì)胞株P(guān)15INK4B 及甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

邊祥海 孫貴富

肝癌惡性程度較高，預(yù)后較差，死亡率高，提高肝癌治愈率及生存期是肝癌研究的重點和難點。研究[1-2]證實，肝癌的發(fā)生與相關(guān)基因甲基化有關(guān)，正常肝臟、肝硬化、肝癌組織中，腫瘤抑制基因甲基化程度呈逐漸增強態(tài)勢，且差異明顯。地西他濱是第一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的用于治療骨髓增生異常綜合征表觀遺傳學(xué)的去甲基化藥物，可以抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶，激活沉默的抑癌基因[3]。三氧化二砷具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，促進(jìn)凋亡及細(xì)胞毒作用，小劑量聯(lián)合用藥有望成為肝癌治療的新出路[4-5]。本研究主要探討兩藥對肝癌SMMC-7721細(xì)胞株P(guān)15抑癌基因及甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 肝癌SMMC-7721細(xì)胞株引自中科院上海細(xì)胞生物研究所；地西他濱注射液（decitabine，DAC，山東魯南制藥集團(tuán)，批號098150301，規(guī)格50mg/瓶）；三氧化二砷注射液（arsenic trioxide，As2O3，北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份公司，批號20130304，規(guī)格10mg/瓶）；四甲基偶氮唑鹽購于美國Sigma公司（批號M2128）；M-MLV試劑盒購于上海Sangon公司（批號RP1100-50T）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞株用含10%熱滅活胎牛血清（56℃，滅活30min）的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 MTT法檢測各組對肝癌SMMC-7721細(xì)胞株的生長抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整密度為 1×104/mL，每孔接種 200μL，DAC 藥物組調(diào)整工作濃度分別為 1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L，As2O3組工作濃度分別為 1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L，聯(lián)合用藥組工作濃度為DAC2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L，空白對照組加入等體積的RPMI 1640培養(yǎng)液和等量的SMMC-7721細(xì)胞懸液，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72h后加入20μL的 MTT（5mg/mL），繼續(xù)孵育 4h，離心棄上清，加入DMSO 200μL/孔，上微型混合器震蕩 20min，使結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀測570nm處吸光度OD值。細(xì)胞增殖抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組×100%。

1.4 RT-PCR檢測P15INK4B、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferases，DNMT1）、DNMT3A、DN MT3B 的mRNA的表達(dá) 收集1.3下藥物處理細(xì)胞，每組約2×106個細(xì)胞，按Trizol法提取細(xì)胞mRNA，配制模板RNA/引物混合液，DNA按試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，基因引物由上海生工基因公司合成：β-actin：上游 5′-CTAATAAGAAAAAGATCAACT-3′; 下游5′-AATCTTTGAAAATATTATTGC-3′（擴(kuò)增產(chǎn)物 497 bp）；P15INK4B：上游 5′-TGGGGGCGGCAGCGATGA G-3′；下游 5′-AG-GTGGGTGGGGGTGGGAAAT-3′（擴(kuò)增產(chǎn)物 450bp）；DNMT1：上游 5′-ACCGCTTCTAC TTCCTCGAGGCCTA-3′；下游 5′-GTTGCAGTCCTCT GTGAACACTGTGG-3′（擴(kuò)增產(chǎn)物335bp）；DNMT3A：上游 5′-CACACAGAAGCATATCCAGGAGTG-3；下游 5′-AGTGGACTGGGAAACCAAATACCC-3′（擴(kuò)增產(chǎn)物 551bp）；DNMT3B：上游 5′-AATGTGAATCCAG CCAGGAAAGGC-3′；下游 5′-ACTGGATTACACTCC AGGAACCGT-3′（擴(kuò)增產(chǎn)物 190bp）。PCR 體系包括：上下游引物各 1μL，Taq DNA合成酶混合型12.5μL，模板 DNA2μL，P15INK4B的 PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5min，94℃ 1min，57℃ 45s，72℃ 60s，βactin反應(yīng)共25個循環(huán)，P15反應(yīng)共30個循環(huán)，72℃延伸5min。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的 25μL；PCR體系包括∶逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2μL，上游及下游引物各1μL，Taq DNA 合成酶混合型 12.5μL；反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性 5min，94℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s，DNMT1、DNMT3A 反應(yīng)共 30 個循環(huán)，DNMT3B反應(yīng)共35個循環(huán)，72℃延伸5min。取反應(yīng)產(chǎn)物 5μL，1.5%瓊脂糖凝膠電泳（1V/cm），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司）記錄，ImageJ軟件分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多組比較用F檢驗，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制率比較 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞具有生長抑制作用,具有劑量和時間依賴性，聯(lián)合組優(yōu)于地西他濱和As2O3單藥組（P＜0.05），見表1。

表1 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制率比較（%，±s）

表1 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制率比較（%，±s）

注：DAC：地西他濱；As2O3：三氧化二砷；聯(lián)合組：DAC 2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L

組別空白組DAC 1.0mmol/L DAC 2.0mmol/L DAC 4.0mmol/L As2O31.0μmol/L As2O32.0μmol/L As2O34.0μmol/L聯(lián)合組孔數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5 F-24h 0 5.2±0.3 16.4±0.6 30.7±0.6 9.7±0.5 33.2±0.5 34.3±0.6 55.8±0.8 9.277＜0.05 48h 0 11.2±0.4 19.1±0.4 22.6±0.4 12.8±1.3 37.5±0.5 38.2±0.3 57.1±3.7 11.317＜0.05 72h 0 15.6±1.1 24.1±0.7 33.8±0.7 14.9±0.8 45.5±1.2 47.9±2.5 69.9±1.2 15.287＜0.05 P-10.314 9.334 13.302 12.368 7.685 9.012 8.525＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05 F P

2.2 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞P15INK4B基因表達(dá)的影響 肝癌SMMC-7721細(xì)胞株的P15INK4B基因不表達(dá)或弱表達(dá)，經(jīng)地西他濱和（或）As2O3作用72h后P15INK4B基因表達(dá)增強，具有劑量依賴性，聯(lián)合組較單藥組比較表達(dá)明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 地西他濱和（或）三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞P15INK4B基因表達(dá)的影響（±s）

表2 地西他濱和（或）三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞P15INK4B基因表達(dá)的影響（±s）

注：DAC：地西他濱；As2O3：三氧化二砷；聯(lián)合組：DAC 2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L

組別空白組As2O31.0μmol/L As2O32.0μmol/L As2O34.0μmol/L DAC 1.0mmol/L DAC 2.0mmol/L DAC 4.0mmol/L聯(lián)合組孔數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5 F P灰度值0.38±0.16 0.34±0.12 0.43±0.14 0.56±0.11 0.33±0.14 0.44±0.19 0.57±0.15 0.74±0.14 22.313＜0.05

2.3 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因表達(dá)的影響 經(jīng)地西他濱和（或）As2O3作用72h后，SMMC-7721細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT3B、DNMT3A和DNMT1mRNA水平下降，具有劑量依賴性，聯(lián)合組與單藥組比較表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 地西他濱和（或）三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶的影響（±s）

表3 地西他濱和（或）三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶的影響（±s）

注：DAC：地西他濱；As2O3：三氧化二砷；聯(lián)合組：DAC 2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L

組別空白組As2O31.0μmol/L As2O32.0μmol/L As2O34.0μmol/L DAC 1.0mmol/L DAC 2.0mmol/L DAC 4.0mmol/L聯(lián)合組孔數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5 F P DNMT3A 0.76±0.12 0.68±0.11 0.58±0.14 0.41±0.13 0.64±0.14 0.50±0.15 0.36±0.13 0.28±0.11 11.297＜0.05 DNMT3B 0.75±0.16 0.67±0.13 0.57±0.15 0.45±0.16 0.67±0.15 0.54±0.14 0.39±0.12 0.32±0.13 16.300＜0.05 DNMT1 0.77±0.16 0.69±0.12 0.58±0.16 0.44±0.12 0.65±0.14 0.59±0.14 0.44±0.19 0.31±0.15 17.453＜0.05

3 討論

研究[1-2]證實肝癌的發(fā)生與DNA甲基化具有密切關(guān)系。在肝癌中，CpG島的啟動子高甲基化與抑癌基因沉默、轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)[6]。地西他濱通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，減少DNA的甲基化，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]。樊伍峰等[8]研究發(fā)現(xiàn)，地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉可以通過激活MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖。三氧化二砷為中藥砒霜的主要成分，我國學(xué)者首創(chuàng)其用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，取得重大突破[4]，研究[9]表明其對肝癌具有一定的治療作用。2011年9月衛(wèi)生部醫(yī)政司頒布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中明確指出亞砷酸注射液為第一個經(jīng)多中心臨床研究證明有效而獲國家食品藥品監(jiān)管局批準(zhǔn)用于肝癌治療的系統(tǒng)性化療藥物。孟真等[10]研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷具有去甲基化作用。彭土生等[11]發(fā)現(xiàn)三氧化二砷能抑制肝HepG2細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力。李海燕等[12]發(fā)現(xiàn)三氧化二砷能夠抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力，機制可能與甲基化有關(guān)。郝立曉等[13]綜述了近年來三氧化二砷聯(lián)合藥物治療肝癌方面的最新進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)三氧化二砷藥物聯(lián)合治療肝癌療效確切。

本研究顯示，地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細(xì)胞具有生長抑制作用，具有濃度和時間依賴性（P＜0.05）。本研究預(yù)實驗顯示，地西他濱在 1.0～4.0mmol/L濃度范圍之間，三氧化二砷在1.0～4.0μmol/L濃度范圍之間對肝癌SMMC-7721細(xì)胞株有較理想的增殖抑制作用，呈一定的時間、劑量依賴關(guān)系（P＜0.05）。為實現(xiàn)低毒高效的抗肝癌細(xì)胞目的，根據(jù)等效半量相加法的聯(lián)合用藥原則，筆者選取三氧化二砷和地西他濱的中間劑量組成聯(lián)合組，同單用藥比較，抑制率均比單用藥高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但是，兩藥聯(lián)合的最佳劑量組合，仍待進(jìn)一步的研究。

研究[14]證實，肝癌中的腫瘤抑制基因與啟動子的高甲基化狀態(tài)有關(guān)，而這些基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、黏附、侵襲及DNA修復(fù)中具有關(guān)鍵作用。周期依賴激酶抑制基因P15通常被認(rèn)為是肝癌錯亂甲基化的靶點之一，INK4B基因表達(dá)P15蛋白，該蛋白質(zhì)是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制性調(diào)節(jié)蛋白[15]。在許多組織中都有表達(dá)，其主要功能是通過與細(xì)胞周期依賴激酶結(jié)合，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。DNMT1是最先被克隆的特異DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，正常組織可呈持續(xù)低表達(dá)，其在維持基因甲基化狀態(tài)中起重要作用。DNMT3A和DNMT3B是近來被克隆的另兩種形式的甲基轉(zhuǎn)移酶，正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，兩者只對CpG位點甲基化修飾，是CpG位點胞嘧啶特異的DNA重新甲基轉(zhuǎn)移酶[16]。甲基轉(zhuǎn)移酶的異常激活，尤其是甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B的異常激活，可能導(dǎo)致肝癌細(xì)胞某些功能基因的啟動子高度甲基化，進(jìn)而可能引起包括P15INK4B基因在內(nèi)的多種功能基因表達(dá)失活。彭建新等[17]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織 DNMT1、3A、3BmRNA 顯著高于其在癌旁組組織/肝硬化組織和慢性肝炎組織中的表達(dá)。我們對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的體外研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)地西他濱和（或）As2O3作用72h后，P15INK4B基因表達(dá)增強，聯(lián)合組較單藥組表達(dá)明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3Bm－RNA、DNMT3A和DNMT1mRNA的水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；地西他濱聯(lián)合三氧化二砷同單藥比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，地西他濱和三氧化二砷對肝癌SMMC-7721細(xì)胞株有增殖抑制作用，并可抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶，增加P15INK4B抑癌基因表達(dá)，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同性。