PLAC4基因用于21三體綜合征無創性產前診斷的可行性分析

胡春風 王翠艷 劉紅英（通訊作者）

（濰坊醫學院遺傳學教研室 山東 濰坊 261053）

21-三體綜合征(Trisomy 21syndrome)，又稱唐氏綜合征(Down's syndrome)，是新生兒最常見的非整倍體染色體疾病[1-3]。主要臨床特征是智力低下，特殊面容和多器官發育遲緩，對人類傷害極大且無有效的治療方法。因此產前篩查和產期診斷是預防該疾病的重要手段[4]。目前臨床常用的染色體核型分析需要依賴有創性手段獲取胎兒細胞，對母胎均有一定的風險[5]，因此無創性產前診斷為近年來的研究熱點。

2007年，Lo等[6]發現21號染色體上的胎盤特異性表達（Placental Specific Expression Gene,PLAC4）基因僅在胎盤表達，具有胎兒特異性。這個發現為應用胎兒游離核酸進行21三體綜合征無創性產前診斷提供了科學依據。隨著基因組技術在產前診斷臨床應用方面取得的最新進展[9,10]，有研究者提出母體血漿中PLAC4基因mRNA的定量分析將會有助于胎兒21三體綜合征的診斷[7,8]。

本研究通過檢測妊娠婦女和非妊娠婦女外周血中PLAC4基因mRNA表達水平差異以及計算分析健康人群PLAC4基因多態性位點雜合度，來探討PLAC4基因在21三體綜合征無創性產前診斷中應用的可行性，為其臨床應用奠定理論基礎。

1.材料與方法

1.1 研究對象

選擇2016年10月—2017年11月在濰坊市人民醫院進行產前檢查的7～16周正常單胎妊娠婦女30例為孕婦組，同期進行健康查體非妊娠婦女30例為對照組，均無內外科疾病和吸煙史。簽署知情同意書后。抽取外周靜脈血5ml，置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝管中，并于低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 外周血PLAC4基因mRNA的表達水平檢測

1.2.1.1 全血RNA的提取 常規提取兩組婦女樣本的總RNA，終產物溶于20μl DEPC-ddH2O中，紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，將提取的總RNA進行標記并保存于-80℃冰箱。

1.2.1.2 PLAC4基因mRNA表達水平的檢測 抽取總RNA 10μl，熒光定量PCR技術檢測兩組PLAC4基因mRNA的表達水平，PLAC4基因PCR引物和探針序列如下：

PLAC4引物上游為5’-AAATGCAGATTCTCAGGTCCTAGTG-3’，下游為5’-TGCCGATGGTTCCTGGAA-3’；

PLAC4 Taqman探針為5’-CTGCAAGGTATTCCTG-3’。反應總體系為25μl，其中cDNA 5μl，2×Premix緩沖液12.5μl，上下游引物各0.2μl，Taqman探針0.2μl。為確保實驗數據的有效性，每次實驗都設陰性對照組和4個標準品，每個樣本都平行做3個復孔。

PLAC4基因的PCR反應條件：94℃預變性2min，93℃變性45s，60℃退火15s。循環10次，最后93℃變性30s，59℃退火45s，30個循環。

1.2.2 PLAC4基因SNP位點雜合度檢測

1.2.2.1 外周血基因組DNA的提取 使用DNA抽提試劑盒（中量血液基因組DNA提取試劑盒-離心柱型，北京天根公司）提取基因組DNA。操作步驟嚴格按照說明書進行。紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度，OD值介于1.8和2.0之間的留用。將提取的基因組DNA進行標記并冷凍于-80℃冰箱。

1.2.2.2 引物設計 查找NCBI數據庫，篩選PLAC4基因上雜合度較高的4個SNP位點，候選位點為rs8130833，rs9977003，rs4818219和rs59066201。依據NCBI數據庫上PLAC4基因序列信息，合成引物序列。

1.2.2.3 檢測SNP位點雜合度 PCR成份組成：10XBuffer 2μl，Template 1μl，Primer F 0.5μl，Primer R 0.5μl，dNTP 0.5μl，TransStart Taq Polymerase 0.2μl，加 ddH2O補至 20μl。

PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30s，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃ 終延伸5min，變性、退火和延伸進行35個循環。

4個位點(rs8130833，rs9977003，rs4818219和rs59066201)的擴增片段長度分別為492bp，487bp，576bp和474bp。

PCR產物經蝦酶消化后，去除部分殘留二聚體和雜質對測序的影響，將樣本送去金唯智公司測序。

2.結果

2.1 外周血中PLAC4基因mRNA的表達水平

兩組婦女外周血PLAC4 mRNA水平比較見表1。孕婦組PLAC4 mRNA表達水平的最小值為3.221×103copy/ml，最大值為13.657×103copy/ml，中位數為7.862×103copy/ml，對照組中均未檢測到PLAC4 mRNA的存在。兩組比較，差異有明顯統計學意義（P＜0.01）。因此，PLAC4mRNA可作為21三體綜合征的無創性產前診斷的生物學標志物。

表1 兩組標本PLAC4 mRNA 水平比較

2.2 PLAC4基因SNP位點雜合度分析

PLAC4基因4個SNP位點PCR產物擴增結果見圖1，4個位點的原始堿基均為A，rs4818219，rs8130833，rs59066201和rs9977003 原始位點A的基因頻率分別為0.7833，0.850，0.700和0.0167，可以計算得出PLAC4基因上3個位點（rs4818219，rs8130833和rs59066201）的雜合度較高，分別為0.339，0.255和0.420（表2），可作為本地人群21三體綜合征無創性產前診斷的候選位點。

圖1 PCR產物電泳結果

表2 SNP位點雜合度分析

3.討論

21三體綜合征是最常見的染色體病之一。近年來，染色體核型分析一直是臨床上21三體綜合征產前診斷的金標準[11,12]。由于該方法是使用有創性手段獲取胎兒細胞，有一定的風險，故不能在孕婦中廣泛開展。因此無創性產前診斷已被大量倡導。近年來學者們致力于探討應用母血中胎兒游離核酸無創性產前診斷21三體綜合征的可行性。

本研究中，我們分別檢測了孕婦組和非孕婦對照組外周血中PLAC4基因mRNA的表達水平，結果顯示，孕婦組PLAC4基因mRNA濃度中位數為7.862×103copy/ml，而非孕婦組中均未檢測到PLAC4基因mRNA的存在，因此PLAC4基因mRNA在兩組婦女外周血中的表達水平存在明顯差異，具有妊娠特異性，可視為21三體綜合征產前診斷的生物學標志物。而且我們利用PCR和DNA測序技術對PLAC4基因上4個SNP位點的雜合度進行了分析。結果顯示其中3個位點，即rs4818219，rs8130833和rs59066201的雜合度高于20%，可作為PLAC4基因21三體綜合征無創性產前診斷的候選位點。

孕婦外周血中胎兒特異性mRNA的發現為無創性產前診斷的研究開辟了新的篇章，從母血中尋找母體不表達的胎兒特異性mRNA，即不存在胎兒有核紅細胞微量的缺點，又成功避開了龐大的母體背景，實為從母血中無創性獲取胎兒遺傳物質的最佳途徑。