黃芪總皂甙對Wnt/β-catenin信號通路及神經干細胞分化的影響

漆國棟，伍亞民，漆偉，劉超智，江瓊

1.重慶醫科大學中醫藥學院，中醫藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市400016；2.中國人民解放軍陸軍軍醫大學附屬大坪醫院野戰外科研究所三室，創傷燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶市400042；3.重慶市中醫骨科醫院，重慶市400010

目的 觀察黃芪總皂甙(TSA)調控體外培養大鼠神經干細胞(NSCs)向神經元方向分化的作用及其有效濃度，并研究其Wnt/β-catenin信號通路相關機制。

方法 新生24 h大鼠大腦皮層來源NSCs進行原代、傳代培養并鑒定，通過CCK-8試劑盒初篩TSA誘導分化的可能有效濃度。取第三代NSCs，設不加TSA的正常組和不同濃度TSA實驗組，分化培養7 d后，間接免疫熒光法和Western blotting檢測微管相關蛋白2(MAP-2)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達。另設正常組、最佳濃度TSA組、TSA+Wnt/β-catenin信號通路抑制劑ICG-001組和ICG-001組，分化培養7 d后，Western blotting檢測各組Wnt3/3a、β-catenin和抗神經原素1(Ngn1)蛋白表達。

結果 TSA在濃度1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L時，NSCs數量顯著增加(P＜0.001)。TSA能增加NSCs分化為神經元的比例，1×10-5mol/L最佳(P＜0.05)。TSA能上調Wnt3/3a、β-catenin與Ngn1蛋白的表達(P＜0.05)。

結論 TSA能促進體外培養NSCs向神經元方向分化，與激活Wnt/β-catenin信號通路，從而調控該通路下游促分化靶向蛋白Ngn1的表達有關。TSA最佳促神經元方向分化濃度約為1×10-5mol/L。

神經干細胞(neural stem cells,NSCs)作為細胞療法的重要細胞類型，近些年已廣泛應用于多種神經系統病變的基礎研究甚至臨床治療，如腦卒中[1]、帕金森病[2]、亨廷頓氏病[3]、脊髓損傷[4]和阿爾茨海默病等[5]。一方面，NSCs可以直接替換損傷或死亡的神經細胞，并通過其增殖能力，持續修復損傷；另一方面，也存在諸如可控性、成瘤性和倫理性等諸多問題。在諸多問題中，關鍵的問題之一在于如何誘導NSCs向神經元方向分化。本課題組前期對黃芪多糖對NSCs增殖與分化的影響進行相關研究[6-7]，發現黃芪多糖促進增殖的效果明顯，但對分化的影響有限。本研究觀察同為黃芪提取物的黃芪總皂甙(total saponins of Astragalus,TSA)能否更有效地誘導NSCs向神經元方向分化。TSA分子式C28H32O17，是中藥黃芪的主要有效成分之一，具有抗凋亡、抗氧化、抗炎和擴張血管等作用[8-9]。TSA對改善運動性疲勞大鼠海馬功能和形態有積極作用[10]；可以促進體外培養的NSCs增殖[11]。本研究探索TSA促進NSCs誘導分化為神經元的最佳濃度范圍，并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

SPF級新生24 h Sprague-Dawley大鼠，購自中國人民解放軍陸軍軍醫大學大坪醫院動物房，動物生產許可證號SCXK(渝)2012-0005。所有操作均根據《醫學實驗動物管理實施細則》要求，符合動物福利與倫理原則。

TSA(17429-69-5，純度 ≥98%)、無菌細胞爬片、CCK-8、DNA酶、DAPI：北京索來寶公司。Neural basal培養基、B-27、Acctuase酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)：美國GIBCO公司。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)：美國PEPROTECH公司。DMEM(含F12培養基、青霉素+鏈霉素雙抗、0.25%胰酶)：美國HYCLONE公司。小鼠單克隆抗nestin抗體：美國MILLIPORE公司。兔多克隆抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體：美國INVITROGEN公司。小鼠單克隆HM-2微管相關蛋白2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)抗體、兔單克隆Wnt3/3a抗體、兔單克隆β-catenin抗體、小鼠單克隆內參GAPDH抗體：英國ABCAM公司。兔多克隆內參β-actin抗體、兔多克隆抗神經原素1(neurogenin 1,Ngn-1)抗體：美國AFFINITY公司。BrdU、小鼠單克隆BrdU抗體：美國SIGMA公司。DyLight488標記山羊抗小鼠二抗、TRITC標記山羊抗兔二抗、HRP標記山羊抗小鼠二抗、HRP標記山羊抗兔二抗：武漢博士德公司。組織蛋白抽提試劑、BCA蛋白濃度測定、蛋白上樣緩沖液、ECL發光檢測試劑盒、Wnt阻斷劑ICG001：上海碧云天公司。10%蛋白電泳預制膠、MOPS電泳液：南京金斯瑞公司。

激光共聚焦顯微鏡：德國LEICA公司。熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司。細胞培養箱、酶標儀、-80℃冰箱：美國THERMO FISHER SCIENTIFIC公司。蛋白電泳、電轉儀：美國BIO-RAD公司。Odyssey FC近紅外雙色激光和化學發光雙功能成像系統：德國LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCs原代培養及傳代

取新生大鼠大腦皮層組織，剪碎為1 mm3左右小塊，0.25%胰酶聯合DNA酶37℃消化10～15 min，FBS終止。藍槍頭吹打10～15次，70 μm細胞篩過濾為單細胞懸液；1000 r/min離心5 min，增殖培養基重懸，2×105/ml密度接種于培養皿，于37℃、5%CO2培養箱中培養，每2～3天半量換液，6～7 d傳代。

1.2.2 NSCs鑒定

1.2.2.1 Nestin

取第三代培養7 d細胞球，接種于多聚賴氨酸包被后的細胞爬片中，培養箱中培養4 h貼壁。去除培養基，PBS洗兩次；4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，每次5 min；0.5%tritonX-100破膜15 min，PBS洗3次，每次5 min；10%正常山羊血清37℃封閉30 min，甩干。加Nestin一抗(1∶200)4℃過夜。室溫復溫30 min，PBS洗3次，每次5 min；加Dylight488標記山羊抗小鼠二抗(1∶100)，37℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；DAPI染核10 min，PBS洗2次，每次5 min；抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦觀察。

1.2.2.2 BrdU

第三代培養3 d細胞培養基中加入10 μmol/ml BrdU培養2 d，接種到包被后的爬片上貼壁，4%多聚甲醛固定，2 mol/L HCl變性，0.1 mol/L NaB4O3清洗。按1.2.2.1染色步驟，一抗改為BrdU一抗(1∶100)，二抗改為Dylight488標記山羊抗小鼠二抗(1∶100)。

1.2.3 CCK-8

取傳代后單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔約7000。設正常組和實驗組：正常組使用不添加TSA的增殖培養基；實驗組分別使用含TSA 1×10-2mol/L、1×10-3mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L的增殖培養基。培養48 h后，每孔加10%培養基體積的CCK-8原液，繼續培養4 h。酶標儀在450 nm處測光密度(optical density,OD)。每組5孔，重復3次。

1.2.4 誘導分化

后來，隨著潁河的多次改道，小商河水日益枯竭，不再是一個水氣氤氳，鳳凰棲身的所在。干涸的河道，凝滯的河水，千年滄桑應如是，迢迢來路應如是。

取第三代神經球經Acctuase酶消化后的單細胞懸液，隨機接種于多聚賴氨酸包被后的六孔板專用無菌爬片中，細胞密度約7.2×104/cm2。設正常組和實驗組：正常組使用不添加TSA的誘導分化培養基，實驗組使用含TSA 1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L(CCK-8篩選的濃度)的誘導分化培養基。2～3 d半量換液，并補足實驗組TSA濃度。7 d后收集細胞行間接免疫熒光染色和Western blotting。誘導分化培養基為含2%B27、2%FBS、1%青霉素+鏈霉素的Neural basal基礎培養基。

1.2.4.1 間接免疫熒光染色

參考1.2.2.1方法，一抗改為MAP-2一抗(1∶500)和GFAP一抗(1∶1000)，二抗為Dylight488標記山羊抗小鼠二抗(1∶100)和TRITC標記山羊抗兔二抗(1∶100)。激光共聚焦下觀察，每組任取5張細胞爬片染色，400倍下隨機選擇細胞數約70左右的5個視野進行統計。每組共統計25個有效視野，計算陽性細胞數并計算陽性細胞占全部細胞的百分比。

1.2.4.2 Western blotting

細胞于冰上用IP細胞裂解液裂解30 min，細胞刮收集裂解液，4℃、12000 r/min離心10 min取上清，BCA法測定蛋白濃度；加相應上樣緩沖液煮沸，每孔上樣25 μg；140 V恒壓電泳，根據預染Marker的分子量切膠，300 mA恒流轉移蛋白至活化的PVDF膜上，雙蒸水洗2次，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗3次，每次5 min。根據分子量分別加MAP-2一抗(1∶2000)、GFAP 一抗(1∶10000)和 GAPDH 一抗(1∶5000)，4℃過夜；TBST洗3次，每次10 min；依一抗不同種屬，分別加HRP標記山羊抗小鼠二抗(1∶5000)、HRP標記山羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫1 h，TBST洗3次，每次10 min，ECL化學發光劑反應，成像系統成像。Image J分析灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白的灰度值比。重復3次。

1.2.5 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白檢測

取第三代NSCs單細胞懸液，分別設立正常組、TSA組、TSA+抑制劑組和抑制劑組，分別采用普通誘導分化培養基，加TSA 1×10-5mol/L誘導分化培養基，加TSA 1×10-5mol/L和ICG-001 25 μmol/L誘導分化培養基，加ICG-001 25 μmol/L誘導分化培養基。每2～3天半量換液并補足TSA和ICG-001，培養7 d后提取總蛋白，同1.2.4.2方法檢測Wnt3/3a、β-catenin、Ngn1相對表達量。一抗改為Wnt3/3a一抗(1∶20000)、β-catenin一抗(1∶5000)、Ngn1一抗(1∶500)和β-actin一抗(1∶3000)，二抗依一抗加HRP標記山羊抗小鼠二抗(1∶5000)和HRP標記山羊抗兔二抗(1∶5000)。Image J分析灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白的灰度值比。重復3次。

1.2.6 統計學分析

圖1 NSCs鑒定(bar=100 μm)

2 結果

2.1 NSCs鑒定

細胞原代培養2～3 d后顯著增殖，呈懸浮聚集成球生長，單個神經球直經≤50 μm。原代培養6～7 d后，神經球變大，直經150～300 μm。第三代培養7 d后，95%以上細胞Nestin陽性，且有BrdU陽性細胞存在(圖1)。

2.2 濃度篩選

與正常組相比，實驗組TSA濃度1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L時，NSCs數增加(P ＜0.05)；TSA濃度1×10-2mol/L時，NSCs數減少(P＜0.05)。見表1。

依據以往經驗，促進NSCs增殖的最佳濃度通常也是促進分化機的最佳濃度，故以TSA 1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L作為后續分化實驗濃度。

2.3 誘導分化

免疫熒光和Western blotting均顯示，各實驗組MAP-2蛋白表達均提高，GFAP蛋白表達均下降，以10-5mol/L效果最佳(P＜0.05)。見圖2、圖3，表2、表3。

圖2 各組免疫熒光染色(bar=100 μm)

表1 各組增殖情況比較(OD)

表2 MAP-2、GFAP陽性細胞數百分比(%)

圖3 MAP-2、GFAPWestern blotting條帶

表3 MAP-2、GFAP蛋白表達(/GAPDH)

2.4 Wnt3/3a、β-catenin、Ngn1蛋白表達

抑制劑組目的蛋白相對表達量低于正常組；TSA+抑制劑組表達量稍有升高，但仍低于正常組；TSA組表達量高于正常組(P＜0.05)。見圖4、表4。

圖4 Wnt3/3a、β-catenin、Ngn1 Western blotting條帶

表4 Wnt3/3a、β-catenin、Ngn1蛋白表達(/β-actin)

3 討論

針對神經系統病變，干細胞療法備受關注，其中又以NSCs移植最有治療前景[12]。NSCs具有自我更新能力，且能通過不對稱分裂方式分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等中樞神經細胞[13]。其分化的神經元可替換損傷或死亡的神經元，修復神經組織，恢復神經信號傳導[14]；其分化的星形膠質細胞能營養支持和保護神經，還可以抑制炎癥等[15]。在運用NSCs治療神經損傷類疾病時，誘導NSCs分化成神經元，從結構上修復損傷的神經，可以發揮最好療效。然而相關實驗表明，NSCs優先分化成星形膠質細胞[16]。如何更好地誘導NSCs向神經元方向分化，成為干細胞療法的熱點和難點。

黃芪為補氣中藥，現代藥理學研究證明，黃芪具有延緩腦退行性變、保護腦血管等多種作用[17-18]。張力等[19]研究表明，黃芪注射液可以促進體外培養的NSCs增殖，對細胞分化也有一定促進作用。黃芪注射液能促進內源性腦組織Nestin表達，并促進NSCs分化為神經元和神經膠質細胞[20]。

黃芪提取物有黃芪多糖、黃芪黃酮和TSA[21]。本研究顯示，TSA在適宜濃度下，可體外誘導NSCs更多向神經元分化，減少分化為膠質細胞的比例，這一作用可能與經典的Wnt/β-catenin信號通路有關。

Wnt蛋白是一種廣泛存在的分泌型蛋白生長因子，作為配體蛋白，可通過調控下游靶蛋白Ngn-1、Ngn-2、cyclinD1和c-myc影響神經細胞分化[22-23]。Wnt3a是Wnt家族的成員，有抑制NSCs增殖，促進向神經元分化的作用[24]。諸多研究表明，激活Wnt/β-catenin信號通路能顯著促進NSCs向神經元分化的比例[25-27]。Ngn1是Wnt/β-catenin信號通路重要的下游靶蛋白，可調控干細胞向神經元方向分化，并降低膠質細胞數量[28]。

本研究經CCK-8初篩，發現TSA在1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L濃度下均能有效促進NSCs增殖。進一步觀察顯示，TSA 1×10-5mol/L促進NSCs向神經元分化的作用最佳。TSA增加Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白表達，這一作用可被通路抑制劑部分阻斷。研究表明，TSA通過提高上游蛋白Wnt3/3a、樞紐蛋白β-catenin表達量，激活Wnt/β-catenin信號通路，增加下游促分化靶向蛋白Ngn1的表達，促進NSCs向神經元分化，降低向星形膠質細胞分化。進一步深化對中藥黃芪藥理作用的理解，并為NSCs移植提出可能的中醫藥聯合方案。TSA精確的最佳濃度，以及是否對體內NSCs具有同樣調控作用，還需要進一步研究。