雷公藤甲素對大鼠坐骨神經冷保存后細胞活性及異體移植后神經再生的影響

汪一，黃英如，張松，李子健，曾歡歡，冼華

重慶醫科大學中醫藥學院，中醫藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市400016

目的 探討雷公藤甲素(T10)對冷保存大鼠坐骨神經生物活性和異體移植后神經再生的影響。

方法 取對數生長期施萬細胞(SCs)，CCK-8檢測1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L T10溶液對SCs增殖的影響。取Sprague-Dawley大鼠雙側坐骨神經15 mm，分別在含0 mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L T10的DMEM液中，4℃或37℃ 放置24 h(n=6)，Western blotting檢測神經生長因子(NGF)、神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、腦源性神經營養因子(BDNF)表達。另取大鼠坐骨神經15 mm，隨機分成新鮮神經組(A組,n=30)、DMEM保存組(B組,n=30)、T10保存組(C組,n=30)、T10預處理后DMEM保存組(D組,n=30)、T10預處理后T10保存組(E組,n=30)，4℃保存4周，Calcein-AM/PI雙染激光共聚焦顯微鏡觀察、流式細胞術檢測神經活細胞、死細胞數，Western blotting檢測主要組織相容性復合體-Ⅰ(MHC-Ⅰ)、MHC-Ⅱ、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達。用上述坐骨神經修復Wistar大鼠坐骨神經10 mm缺損(A′組、B′組、C′組、D′組、E′組,n=10)，設立同系移植新鮮組(F′組,n=10)。術后16周，電生理檢測肌肉復合動作電位(CMAP)和運動神經傳導速度(MNCV)；取移植段神經，觀察神經纖維數和神經超微結構。

結果 SCs在濃度為1×10-9～1×10-7mol/L T10溶液下，細胞增殖與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。各濃度T10溶液下，大鼠坐骨神經各神經營養因子表達均37℃明顯高于4℃；相同溫度時，1×10-8mol/L組各神經營養因子表達均高于其他濃度組(P＜0.05)。大鼠坐骨神經冷保存4周后，與B、C、D組相比，E組神經活細胞數量多，MHC-I、MHC-II、ICAM-1表達降低(P＜0.05)。移植術后16周，E′組CMAP、MNCV、再生有髓神經纖維數量均優于A′、B′、C′、D′組(P＜0.05)，E′、F′組有髓神經纖維數量多，粗細均勻，分布廣泛，髓鞘厚。

結論 一定濃度T10體外能誘導大鼠坐骨神經神經營養因子表達，提高冷保存神經生物活性，降低免疫原性，促進異體移植后受體神經再生；冷保存前用一定濃度T10預處理效果更好。

自體神經移植作為周圍神經缺損，尤其是長段神經缺損的主要治療手段，因來源有限和造成新的神經缺損等隱患，制約了其臨床應用。同種異體神經具有與自體神經相同的組織結構，可能是自體神經最好的替代物[1-2]。實現同種異體神經的臨床化應用，成功的體外保存是基礎。周圍神經的體外保存面臨缺血、缺氧和低溫環境，會造成組織細胞損傷，導致周圍神經的施萬細胞(Schwann cells,SCs)失去活性甚至死亡；而SCs是周圍神經的主要結構和功能細胞，能分泌多種神經營養因子和黏附分子，對神經損傷后軸突再生極為重要[3-4]。維持SCs的生物活性是周圍神經體外保存的關鍵。

雷公藤甲素(triptolide,T10)是我國傳統中藥雷公藤的主要藥理活性成分之一，具有抗炎和免疫抑制等作用[5-6]。T10可保護PC12細胞免受氧化應激引起的細胞損傷和凋亡，具有保護神經元、改善神經功能的作用[7-9]；還能促進神經膠質細胞合成和分泌多種神經營養因子[10]。本研究觀察T10對低溫保存大鼠坐骨神經生物活性和異體移植后受體神經再生的影響，以提高周圍神經低溫保存的成功率。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和動物

大鼠SCs株(RSC96細胞株)：中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，目錄號GNR 6。

SPF級雌性Sprague-Dawley大鼠300只，體質量(200±20)g，重慶醫科大學動物中心提供，動物生產許可證號SCXK(渝)2012-0001。Wistar雌性大鼠60只，體質量(200±20)g，成都達碩實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK(川)2015-030。動物實驗均根據《醫學實驗動物管理實施細則》的要求，依照動物福利與倫理原則處理。12 h明暗交替，相對濕度65%～75%，室溫22～24℃。

1.2 試劑與儀器

T10：上海Aladdin公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMSO、0.25%胰酶、Ⅱ型膠原酶、低糖型DMEM培養基、DMEM/F12培養基：美國HYCLONE公司。RPMI1640培養基：美國GIBCO公司。青霉素-鏈霉素雙抗：上海碧云天生物技術有限公司。神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、神經膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、主要組織相容性復合體-Ⅰ(major histocompatibility complex-Ⅰ,MHC-Ⅰ)、MHC-Ⅱ、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)單克隆抗體：美國SANTACRUZ公司。β-actin：武漢中杉金橋生物技術有限公司。山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗：北京中杉金橋生物技術有限公司。CCK-8：日本DOJINDO公司。tritonX-100：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。Calcein-AM：日本東仁化學科技有限公司。碘化丙啶(propidium iodide,PI)：上海前塵生物科技有限公司。FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒Ⅰ：美國BD BIOSCIENCES公司。蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術研究所。

EPICS-XL型流式細胞儀：美國BECKMANCOULTER公司。LEICA TCS SP2激光掃描共聚焦顯微鏡：德國LEICA公司。蛋白質垂直電泳槽、穩壓穩流電泳儀、圖像分析軟件：美國BIO-RAD公司。VICTOR3酶標儀、Geliance 200凝膠成像系統：美國PERKENELMER公司。低溫高速離心機：德國SIGMA公司。H-7500透射電鏡：日本HITACHI公司。

1.3 方法

1.3.1 T10冷保存大鼠坐骨神經的適宜濃度

1.3.1.1 對SCs毒性

取處于對數生長期SCs，0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，半徑6 cm、1000 r/min離心5 min后棄上清，用含10%FBS的DMEM/F12培養基調整細胞濃度為 1×104/ml，接種于 96 孔板中，每孔 200 μl，37℃、5%CO2培養箱繼續培養。細胞貼壁后用無血清培養基培養24 h。棄上清，加入含T10 1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L的DMEM溶液(含10%FBS、4%DMSO、1%青-鏈雙抗)，每孔200 μl；對照組加等量DMEM溶液，并設置加入等量蒸餾水的無細胞空白組。每組設5個復孔。37℃、5%CO2培養24 h。終止培養前2 h，每孔加CCK-8試劑20 μl。酶標儀450 nm波長下檢測各孔吸光度(A)；計算各組細胞存活率：

重復3次。

1.3.1.2 坐骨神經神經營養因子分泌

Sprague-Dawley大鼠適應性喂養5 d后，空腹24 h，SPF動物房無菌操作臺上消毒后鋪巾，10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，于梨狀肌下緣5 mm處截取大鼠雙側坐骨神經各約15 mm，生理鹽水沖洗。隨機數字表法將大鼠坐骨神經浸在含T10 0 mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L的DMEM溶液中，4℃或37℃、5%CO2細胞培養箱預處理24 h(n=6)。Western blotting檢測NGF、GDNF和BDNF蛋白表達。

取神經組織約30 mg，10 ml/kg加入裂解液，勻漿，靜置1 h；12000 r/min離心15 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜，加一 抗 (NGF 1∶ 1000、 GDNF 1∶ 1000、 BDNF 1∶2000、GAPDH 1∶5000)4℃孵育過夜；TBST洗膜，加山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜，ECL顯色。Image J軟件處理，以GAPDH為內參，計算目的蛋白與GAPDH的灰度比。生物學重復6次。

1.3.2 坐骨神經冷保存

同法另取SPF級雌性Sprague-Dawley大鼠坐骨神經15 mm，隨機數字表法分成5組(n=30)。A組不進行任何處理；B組在DMEM溶液中4℃保存4周；C組在含1×10-8mol/L T10的DMEM溶液中4℃保存4周；D組在含有1×10-8mol/L T10的DMEM溶液中，37℃、5%CO2預處理24 h，然后在DMEM溶液中4℃保存4周；E組在含有1×10-8mol/L T10的DMEM溶液中，37℃、5%CO2預處理24 h，然后在含1×10-8mol/LT10的DMEM溶液中4℃保存4周。

1.3.2.1 坐骨神經活性

取各組坐骨神經各4條(A組檢測時取材，下同)，修剪成2 mm，浸入1%tritonX-100中通透30 min，PBS沖洗；室溫Calcein-AM 20 μmol/L孵育30 min，PBS洗滌；PI 50 mg/L染色15 min，PBS洗滌；防熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察，激發波長490 nm和535 nm，活細胞呈綠色熒光，死細胞呈紅色熒光。觀察熒光強度。

將坐骨神經置含10%胎牛血清的PBS中，加入Ⅱ型膠原酶，37℃振蕩1 h；置不含胎牛血清的RPMI1640培養基的平皿中，洗滌、剪切后研碎，200目過濾，制成單個細胞懸液，4℃、半徑6 cm、1000 r/min離心5 min。細胞37℃、5%CO2培養箱中培養6 h，收集細胞，洗滌，根據Annexin V FITC/PI試劑盒說明染色，EPICS-XL流式細胞儀檢測。

1.3.2.2 免疫原性

按照1.3.1.2方法，檢測各組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1表達，以β-actin為內參。

1.3.3 同種異體移植效果

雌性Wistar大鼠60只，10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，右股后外側縱行切口，鈍性分離，游離坐骨神經，距梨狀肌下緣5 mm處整齊切除坐骨神經10 mm。分別取A、B、C、D和E組神經，修剪成10 mm，手術顯微鏡下，9-0線行神經外膜無張力間斷縫合4～6針(A′組、B′組、C′組、D′組、E′組,n=10)。逐層關閉切口。手術由同一人操作，術后不做特殊處理。

SPF級Wistar雄性大鼠5只，同法取坐骨神經10條，修復Wistar雌性大鼠坐骨神經10 mm缺損組(F′組,n=10)。

觀察術后大鼠精神狀態、飲食、傷口愈合、潰瘍發生情況。

1.3.3.1 神經電生理檢測

移植術后16周，大鼠10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，原切口暴露坐骨神經。觀察移植神經段粗細、與周圍組織粘連情況等。刺激電極置梨狀肌下緣3 mm處神經干，接收電極置外踝上10 mm腓腸肌中部，地線遠離兩電極，刺激強度1 V，間歇0.25 ms。BL-420F系統測定肌肉復合動作電位(compound muscle action potential,CMAP)和神經傳導速度(never conduction velocity,NCV)。

1.3.3.2 組織學觀察

電生理檢測后，整齊截取移植神經中段3 mm，2.5%戊二醛4℃固定過夜，1%鋨酸固定2 h，丙酮梯度脫水，環氧樹脂包埋。0.5 μm半薄切片，甲苯胺藍染色，每個樣本隨機選5張切片，每張切片隨機取5個視野，CCD光譜測量系統觀察，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計數有髓神經纖維數目。超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察神經超微結構，計算有髓神經纖維髓鞘厚度與神經纖維直徑的比。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。實驗數據均以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 T10冷保存大鼠坐骨神經的適宜濃度

2.1.1 對SCs毒性

T10濃度為1×10-6mol/L時，SCs存活率下降(P＜0.05)。其他濃度下，SCs存活率與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 不同濃度T10下SCs存活率比較(%)

2.1.2 坐骨神經神經營養因子分泌

各組均可檢測出NGF、BDNF、GDNF蛋白表達。37℃預處理各組，NGF、BDNF、GDNF蛋白表達均高于4℃預處理各組(P＜0.05)。

4℃預處理時，NGF表達在1×10-8mol/L T10組最高(P ＜ 0.05)；GDNF表達1×10-8mol/L T10組、1×10-9mol/L T10組最高(P ＜0.05)；BDNF表達1×10-8mol/L T10組、1×10-9mol/LT10組最高，1×10-7mol/LT10組次之(P＜0.05)。

37℃預處理時，NGF表達在1×10-8mol/L T10組最高(P ＜ 0.05)；GDNF表達1×10-8mol/L T10組、1×10-9mol/L T10組最高，1×10-6mol/L T10組、1×10-7mol/L T10組次之(P＜0.05)；BDNF表達，1×10-7mol/L T10組、1×10-8mol/L T10組最高，1×10-9mol/L T10組次之，1×10-6mol/L T10組高于對照組(P＜0.05)。

見圖1、表2。

圖1 不同溫度、濃度T10預處理坐骨神經各神經營養因子蛋白表達

表2 不同溫度、濃度T10預處理坐骨神經各神經營養因子蛋白表達(/β-actin)

2.2 坐骨神經冷保存

鑒于以上實驗提示，1×10-8mol/L T10促神經營養因子分泌最佳，故以下實驗均按此濃度添加T10。

2.2.1 MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1蛋白表達

與A組相比，B、C、D、E組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1蛋白表達均下降(P＜0.05)。B、C、D、E組中，MHC-Ⅰ表達，E、C組最低，D組次之，B組最高(P＜0.05)；MHC-Ⅱ、ICAM-1表達，E組最低，C組次之，D組又次之，B組最高(P＜0.05)。見圖2、表3。

2.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察

A組以綠色熒光為主，可見零星紅色熒光分布；B、C、D、E組紅色熒光強度較A組增加，綠色熒光強度減少。B、C、D、E組中，E組綠色熒光強度最強，紅色熒光強度最低，C、D組次之，B組最差。見圖3。

2.2.3 流式細胞儀檢測

A組90%以上為活細胞，B、C、D、E組活細胞百分比均較A組降低。B、C、D、E組中，E組活細胞百分比最高，C組次之，B、D組最低(P＜0.05)。見圖4、表4。

圖2 冷保存下各組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1蛋白表達

表3 冷保存下各組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1蛋白表達(/β-actin)

表4 流式細胞儀檢測各組存活率(%)

圖3 冷保存各組神經細胞存活(免疫熒光染色,bar=50μm)

圖4 冷保存各組神經細胞存活和凋亡的流式細胞儀檢測

2.3 同種異體移植

2.3.1 一般情況

各組大鼠術后切口均未出現感染，實驗期間無大鼠死亡，無足底潰瘍、足趾脫落等損害。取材時，發現A′、B′、C′、D′、E′組神經移植段與周圍組織輕度粘連，遠近吻合口輕微膨大；F′組移植神經與周圍組織無明顯粘連，遠近吻合口無明顯膨大。

2.3.2 神經電生理

移植術后16周，各組間CMAP、NCV均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，F′組最高，E′組次之，再次為C′、D′組，A′、B′組最低(P ＜ 0.05)。見表5。(P＜0.05)。見圖5、表6。

表5 移植術后各組神經電生理檢查結果

電鏡觀察，F′組和E′組可見大量有髓神經纖維，纖維粗細均勻；C′組和D′組再生有髓神經纖維數量較多，分布較廣泛；A′組和B′組再生有髓神經纖維數量較少，分布較稀疏，可見明顯結蹄組織增生。有髓神經纖髓鞘厚度與神經纖維直徑的比，F′組＞E′組＞C′組 ＞ D′組 ＞A′組 =B′組(P ＜ 0.05)。見圖6、表6。

表6 移植術后各組再生神經纖維情況

2.3.3 組織學觀察

各組之間有髓神經纖維數有非常高度顯著性差異(P ＜ 0.001)，F′組 ＞ E′組 ＞ C′組 ＞ D′組 ＞ A′組 ＞ B′組

圖5 移植術后16周移植神經中段(甲苯胺藍染色,bar=50μm)

圖6 移植術后16周移植神經中段超微結構(透射電鏡,bar=10μm)

3 討論

自體神經移植因來源受限、供區并發癥等缺點，不能滿足周圍神經缺損修復的需要；同種異體神經具備相同的組織結構，且來源豐富，可能是自體神經最佳替代物。與器官移植一樣，有效的體外保存成為移植技術的重要限制因素。目前國內外尚無公認的周圍神經體外保存方法。

T10是中藥雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎、免疫抑制作用。我們在坐骨神經保存液中添加一定濃度T10，希望能對低溫保存的坐骨神經發揮保護作用。考慮到T10的毒性，我們先進行SCs細胞毒性試驗，結果表明，T10在1×10-9～1×10-7mol/L濃度下，對SCs無明顯毒性作用。

T10能促進體外培養的星形膠質細胞分泌神經營養因子[11]，而神經營養因子除了促進神經損傷后軸突生長和對新生軸突的導向作用外[12-13]，還有營養作用和促神經細胞存活的作用，對周圍神經損傷后神經細胞具有保護作用[14-15]。本研究顯示，1×10-8mol/L T10溶液37℃預處理24 h，神經營養因子表達最多；T10中冷保存4周后，經上述T10預處理的神經活細胞最多。推測大鼠坐骨神經用一定濃度T10溶液預處理和保存，能對大鼠坐骨神經起到疊加保護作用。

免疫排斥反應是影響同種異體周圍神經移植成功的重要因素，理想的體外保存異體神經應在盡量保留神經活性細胞的前提下，降低神經免疫原性。MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1在移植排斥反應中起重要作用[16-17]：MHC-Ⅰ分子由CD8+細胞毒性T淋巴細胞識別，MHC-Ⅱ分子與CD4+T細胞活化、增殖密切相關，而CD8+、CD4+T細胞是介導同種異體排斥反應的關鍵細胞；ICAM-1在T細胞黏附、激活及侵入等環節發揮作用[18-20]。雷公藤制劑有抗排斥反應作用[21]，在體外能抑制MHC、共刺激分子表達，削弱抗原呈遞細胞抗原呈遞功能和對T細胞的激活作用[22]。本研究顯示，大鼠坐骨神經4℃冷保存4周后，各組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1表達均較新鮮神經降低，可能與冷保存后SCs活性下降、凋亡增加有關；而T10冷保存能進一步抑制神經移植物MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1表達，從而降低異體移植后急性期排斥反應。

本研究用不同方法冷保存的Sprague-Dawley大鼠坐骨神經修復Wistar大鼠坐骨神經缺損，術后16周觀察，T10保存、T10預處理的神經，治療效果較佳；兩者合用效果更佳。神經損傷后，隨著時間推移，其支配的靶肌肉將發生不可逆萎縮，失去功能，其功能恢復與神經軸突的再生關系密切[23-24]。NCV與神經纖維直徑相關，再生纖維傳導速度的恢復，很大程度上取決于髓鞘厚度的恢復，髓鞘厚度也是再生纖維成熟程度的反映[25]。本研究顯示，T10保存、T10預處理的神經，再生效果良好。這可能由于T10對低溫保存的神經組織具有保護作用；同時，T10預處理可通過促進神經組織分泌神經營養因子，提高SCs活性；還能降低免疫原性，從而有利于異體移植后神經軸突再生，促進坐骨神經功能恢復。

綜上所述，T10預處理能促進坐骨神經神經營養因子表達；經T10預處理后的坐骨神經，在保存液中添加T10，可提高SCs活性，降低免疫原性，從而減弱移植后排斥反應，促進神經再生及功能恢復。