IL-15對異基因抗原刺激下人CD8+T 細胞增殖分化影響的初步研究①

馮 富 劉艷君 劉桂歡 張 華 朱漫漫 朱 平 劉久敏 余玉明

(南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東省人民醫院泌尿外科(廣東省醫學科學院)，廣州510080)

以調節性T細胞為中心的移植免疫耐受誘導研究在近二十年成為人們研究的熱點[1,2]。其中人CD28-CD8+抑制性T細胞(T suppressor cells,Ts)作為一種異體抗原免疫的重要調節細胞逐漸引起人們的重視。人CD28-CD8+Ts在不同疾病環境和移植免疫中均被證明發揮著重要作用[3-6]。我們之前的研究利用白細胞介素15(Interleukin 15，IL-15)聯合其他細胞因子[7]或單獨應用IL-15，并在異體抗原刺激下，在體外大量擴增出具有抗原特異性抑制作用的人CD28-CD8+Ts細胞。在研究中我們發現，人CD8+T細胞經過體外擴增產生CD28-CD8+Ts細胞的同時，也產生具有細胞毒性的CD28+CD8+T細胞。由此，我們提出疑問，相較于特異性免疫應答中CD8+T細胞受到病原體活化后發生增殖分化的特點，在本實驗體系中，在外源性IL-15和同種異體抗原刺激下，CD8+T細胞增殖分化的特征如何？擴增產生的細胞毒性CD28+CD8+T細胞與人外周血新鮮分離的CD28+CD8+T細胞有何異同？針對以上問題的研究對揭示同種異體抗原刺激下人CD8+T細胞增殖分化特征具有重要意義，對理解臨床移植環境下移植排斥反應和耐受誘導及監測具有重要參考價值。由此，我們對CD28-CD8+Ts細胞體外擴增體系下CD8+T細胞增殖分化的動態規律進行了研究，并報告如下。

1 材料與方法

1.1研究對象樣品來源與HLA配型 人外周單個核細胞(PBMC)樣品均來源于已簽署知情同意書的健康志愿者(本次實驗研究共招募健康志愿者131位，以在校大學生為主)。由深圳市億立方生物技術有限公司用分子生物學方法進行HLA配型檢測。選擇HLA-A，-B 和-DR完全錯配的志愿者分別設為A,B和I個體分別模擬供、受者和無關者組成多個實驗組。

1.2方法

1.2.1PBMC分離和細胞分選 采集健康志愿者新鮮外周靜脈血，肝素抗凝。將血液樣本加入淋巴細胞分離液中，采用密度梯度離心分離PBMC。分別用CD8和CD4免疫磁珠試劑盒(應用Miltenyi Biotech公司產品)分離純化CD8+T細胞(純度>98%)和CD4+T細胞(純度>98 %)，分離步驟按照產品說明書進行。新鮮的PBMC用CD2免疫磁珠試劑盒(應用Miltenyi Biotech公司產品)進行陰性選擇，去除CD2+細胞，獲取抗原提呈細胞(APC)。將IL-15體外誘導后的細胞應用CD28免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotech公司產品)進行選擇，分別獲得CD28-CD8+T細胞(純度>95%)和CD28+CD8+T細胞(純度>98%)。

1.2.2CD28-/CD28+T細胞的體外誘導 培養基為RPMI1640培養液，加入胎牛血清(均為Gibco公司產品)，組成體積分數為15%的完全培養基。來源于A個體的2×106個CD8+T細胞作為反應細胞，B個體的1×106個HLA完全錯配的APC作為刺激細胞，置于24孔細胞培養板，加入含有IL-15(50 ng/ml，PeproTech公司產品)的2 ml培養基中，置于37℃、體積分數5%CO2的細胞培養箱中培養，分別在第3、5和7天更換新鮮培養基。培養第5、7天收獲每孔細胞，洗滌并分為2孔，繼續培養，第9天收獲細胞，并按照前述方法分離純化出CD28-T細胞和CD28+T細胞，用于后面的毒性檢測及表型檢測實驗。

1.2.3CD28-/CD28+T細胞的細胞毒性或細胞殺傷活性 作為靶細胞的APCs標記有兩種濃度CFSE熒光：標記有高濃度(2.0 μmol/L)CFSE的原致敏APCs(B-APC-CFSEhigh)和標記低濃度(0.2 μmol/L)CFSE來自HLA-A,-B和-DR全錯配無關供者的APCs(I-APC-CFSElow)。在同種異體APCs存在下，IL-15體外誘導的CD28-CD8+T細胞和其對應的CD28+CD8+T細胞分別作為效應細胞。將I-APC-CFSElow∶B-APC-CFSEhigh的比值設定為R。培養0、24、72和120 h后，利用流式細胞儀檢測I-APC-CFSElow和B-APC-CFSEhigh細胞數目，計算不同時間點I-APC-CFSElow和B-APC-CFSEhigh細胞數的比率R，不同時間點該比率的變化反映了效應細胞對靶細胞群B-APC-CFSEhigh的特異性殺傷作用。

1.2.4流式細胞術分析 本研究實驗所采用的抗人流式熒光單克隆抗體均購自eBioscience公司，包括：別藻青蛋白(APC)標記的抗人CD4和CD28單克隆抗體，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗人CD2和CD122單克隆抗體，藻紅蛋白(PE)標記的抗人Perforin、CD25、CD178(FasL)、CD215、Granzyme B和CD132單克隆抗體，PE和花青苷5(Cy5)標記的抗CD8單克隆抗體，以及相關同型對照抗體。染色方法按照產品說明進行，染色后應用LSR Fortessa 流式細胞儀(BD Bioscience 公司)進行數據收集，用FlowJo vX.0.7 軟件進行數據分析。

2 結果

2.1IL-15體外擴增產生的CD28+CD8+和CD28-CD8+T細胞具有相反的細胞毒特性 將A-CD8+T細胞作為反應細胞，B-APCs作為刺激細胞，經IL-15體外擴增出的CD28-CD8+Ts和CD28+CD8+T細胞分別作為假定的殺傷細胞，將原致敏B-APCs(B-APC-CFSEhigh)和HLA完全錯配的I-APC(I-APC-CFSElow)作為靶細胞共同培養。如圖1所示，在0、24、72和120 h，當培養體系中只有B-APCs與I-APCs時，R值在各檢測時間點均維持不變(R=1)；當將CD28+CD8+T細胞加入培養體系后，在72和120 h R值分別升高為1.25和2.57；而當將CD28-CD8+Ts加入培養體系后，R值在各個時間點均維持不變(R=1)。結果表明，CD28+CD8+T細胞與原致敏B-APCs相接觸時，可以特異性地殺傷B-APCs導致R值增高，具有細胞毒性；而CD28-CD8+Ts對原致敏細胞(B-APCs)則不產生特異性的毒性殺傷作用。

2.2IL-15擴增后CD28+CD8+和CD28-CD8+T細胞的表型特性 我們檢測了異體抗原刺激下，IL-15擴增產生的CD28+CD8+和CD28-CD8+T細胞與正常人外周血新鮮分離的相應細胞亞群的表型并進行對比。如圖2A所示，正常人外周血新鮮分離的CD28-CD8+T細胞高表達CD122[(40.15±3.18)%]、顆粒霉素-B[(73.00±3.25)%]和穿孔素[(79.25±5.44)%]等分子，低表達 CD215[(0.10±0.02)%]、CD25[(0.67±0.33)%]和FasL[(0.04±0.01)%]等分子。經IL-15誘導擴增后的CD28-CD8+Ts低表達了CD122[(7.69±0.13)%]、顆粒霉素-B[(4.33±0.52)%]和穿孔素[(0.44±0.06)%]等分子，而高表達了CD132[(68.20±2.83)%]和CD25[(81.50±4.53)%]，其中FasL[(0.06±0.03)%]維持低水平表達。而與正常人外周血新鮮分離的CD28+CD8+T細胞相比，經IL-15誘導后CD28+CD8+T細胞高表達了CD25(88.26±14.03)、CD122(6.31±0.06)、CD132(60.43±16.99)、FasL(6.65±3.23)、顆粒霉素-B(23.80±1.13)和穿孔素(6.04±0.48)分子(圖2B)。雖然不同組個體的CD28+CD8+和CD28-CD8+T細胞表面分子表達情況存在個體差異，但在3次獨立實驗中，表型上調或下調的趨勢保持一致。

2.3IL-15對CD28+T細胞膜上CD28分子的影響 為了進一步了解IL-15誘導異體抗原刺激下CD8+T細胞增殖分化的機制，對CD28分子在不同培養條件下的動態規律進行了觀察。我們發現，如圖3A所示，在正常人外周血新鮮分離的CD8+T細胞中，CD28-細胞亞群只占很小比例，遠低于CD28+細胞，CD28-/CD28+T細胞數比例為0.24；當CD8+T細胞與異體抗原培養9 d后，CD28-/CD28+T細胞數比進一步降至0.15；但是，若在異體抗原刺激下，同時加入IL-15，CD28-/CD28+T細胞數比反而升高至1.01。表明IL-15可促進CD28-CD8+T細胞的增殖分化。進一步將外周血新鮮分離的CD28+CD8+T細胞與異體抗原提呈細胞共同培養(圖3B)，發現增殖細胞中CD28+T細胞占絕大多數(95.42%)；當在培養體系中加入IL-15時，增殖細胞中CD28+T細胞比例顯著減少(61.60%)，而CD28-T細胞比例明顯增多(P<0.05)。以上結果顯示，CD8+T細胞在異體抗原刺激下進行增殖分化，如果無IL-15存在，增殖分化的細胞將主要是CD28+T細胞，如果加入IL-15，CD28-T細胞無論從數量上，還是增殖的比例上都將顯著增加，即IL-15更偏向促進CD28-CD8+T細胞增殖。

圖1 CD8+T細胞擴增產生的CD28-CD8+和CD28+CD8+T細胞具有不同的細胞毒特性 (n=3)Fig.1 CD28-CD8+and CD28+CD8+T cells expanded from CD8+T cells have adverse cytotoxic characteristics (n=3)

圖2 IL-15誘導CD28-/CD28+T細胞的表型特性(n=3)Fig.2 Phenotypic characteristics of CD28-/CD28+T cells induced by IL-15 (n=3)

圖3 IL-15對CD8+T細胞增殖分化中CD28分子的影響 (n=3)Fig.3 Effect of IL-15 on CD28 molecules during the proliferation of CD8+T cells(n=3)

3 討論

CD8+T細胞是特異性免疫應答的主要效應細胞，可特異性識別、殺傷靶細胞或病原體[8]，在移植免疫中，CD8+T細胞識別異基因抗原，活化增殖后可殺傷異基因細胞，破壞移植物，參與排斥反應。我們前期研究通過IL-15聯合其他細胞因子或單獨應用IL-15，可在體外擴增出大量CD28-CD8+Ts細胞，這些細胞具有抗原特異性抑制作用而無細胞毒作用；但同時發現，一同擴增產生的CD28+CD8+T細胞具有抗原特異性細胞毒作用。本實驗體系中，在IL-15誘導下，CD8+T細胞經B-APCs刺激增殖產生的CD28+CD8+T細胞可特異性地殺傷B-APC-CFSEhigh，但對HLA完全錯配的無關供者I-APC-CFSElow無細胞毒性作用，說明由CD8+T細胞增殖分化而來的CD28-CD8+和CD28+CD8+T細胞具有完全不同的特性。

有研究顯示，CD28-CD8+Ts能促進耐受性的樹突狀細胞(DC)發生增殖并增加其在同種異體心臟移植受者中表達[9]，還可誘導移植免疫耐受，使器官移植術后免疫抑制藥物用量大大降低[10]，但也有研究表明，器官移植后患者體內CD28-CD8+T細胞增加與移植器官預后不良相關[11]。本研究結果提示，上述兩種看似矛盾的觀點可能緣于同一種細胞增殖分化過程，即異基因抗原刺激下，受者體內CD8+T細胞增殖分化為CD28-CD8+和CD28+CD8+T細胞兩種具有不同功能的亞群，在復雜環境下出現某種亞群占優勢的情況。

圖2結果進一步表明，體外擴增產生的CD28-CD8+Ts與外周血新鮮分離的CD28-CD8+T細胞相比，低表達FasL、顆粒霉素-B和穿孔素等分子，擴增后同時產生的CD28+CD8+T細胞與外周血新鮮分離的同類細胞相比，高表達FasL、顆粒霉素-B和穿孔素分子，這些分子被公認為CTL發揮細胞毒性殺傷靶細胞的效應性分子[12-14]，進一步解釋了IL-15誘導產生的CD28-CD8+Ts不具有細胞毒功能，而CD28+CD8+T細胞可特異性地殺傷靶細胞，具有細胞毒功能。

IL-15可以誘導CD8+T細胞增殖及分化為效應性或抑制性T細胞[7,15]。其在T細胞膜上具有異源三聚體受體，包括α受體(CD215)、β受體(CD122)和γ受體(CD132)[16]。與外周血新鮮分離的CD28-CD8+T細胞相比，體外擴增產生的CD28-CD8+Ts上調了CD132(IL-15Rγ)表達，下調了CD122(IL-15Rβ)表達，CD215(IL-15Rα)表達維持低表達水平；與外周血新鮮分離的CD28+CD8+T細胞相比，體外擴增產生的CD28+CD8+T細胞上調了CD132(IL-15Rγ)表達，同時上調了CD122(IL-15Rβ)表達，CD215(IL-15Rα)表達維持低表達水平。提示IL-15可能主要通過IL-15γ受體(CD132)促進CD28-CD8+Ts和CD28+CD8+T細胞增殖[16]；CD122(IL-15Rβ)分子可能與細胞毒性相關[17,18]。CD25分子高表達，表明了IL-15誘導產生的兩群細胞高度活化成為具有相應功能的細胞。

IL-15可誘導CD8+T淋巴細胞增殖[19]，但在移植環境下，IL-15影響CD8+T淋巴細胞增殖分化的動態規律研究較少。本研究發現(圖3A)，正常人外周血CD8+T細胞中，CD28+CD8+T細胞占據較大比例，加入異基因抗原提呈細胞刺激后，CD8+T細胞將增殖分化，但增殖分化的細胞中，CD28+CD8+T細胞仍然占據較大比例；但是，當加入IL-15后，增殖分化的細胞中CD28-CD8+T細胞反而占據較大比例。外周血新鮮分離的CD28+CD8+T細胞與異基因APC培養后，增殖細胞絕大多數仍然是CD28+表型，但是當加入IL-15后，CD28-表型顯著增加(圖3B)。以上研究表明，在異基因移植環境下，IL-15顯著提高了CD28-CD8+T細胞增殖，還可誘導CD28+CD8+T細胞膜上CD28分子丟失。有研究表明，人腎小管上皮細胞可以產生IL-15[20,21]，IL-15也是外周CD28-CD8+T細胞存活的必需細胞因子[22]。這是否提示人類異基因移植后，患者體內可以通過分泌IL-15提高體內的CD28-CD8+Ts水平，從而協助維護機體達成臨床免疫耐受？這或許解釋了移植術后患者體內可檢測出較高水平的CD28-CD8+Ts的原因[23]。但是，研究也顯示，人體內IL-15處于極低表達水平[16]，移植后如何影響CD8+T細胞的增殖分化仍然不清楚。此外，鑒于IL-15誘導產生CD28-CD8+Ts的同時也產生具有細胞毒作用的CD28+CD8+T淋巴細胞，如何理清異基因移植環境下CD8+T細胞增殖分化的確切規律，仍需要結合臨床病例進一步深入研究。

綜上，本研究結果顯示，在外源性IL-15和同種異體抗原刺激下，CD8+T細胞增殖分化后產生CD28-CD8+Ts細胞的同時也產生具有細胞毒特性的CD28+CD8+T細胞。兩個細胞亞群表現出不同的表型特征。IL-15通過調節CD28分子的表達影響CD8+T細胞對異基因抗原的增殖分化。本研究對揭示臨床移植環境下，異基因抗原刺激下人CD8+T細胞增殖分化特征，對理解移植排斥反應和耐受誘導及監測具有重要意義。