熒光免疫層析定量檢測髓過氧化物酶方法的建立①

王云龍 馬雪虎 李玉林 王繼創 潘維成 閆生輝

(鄭州大學生命科學學院，鄭州450001)

冠心病(Coronary heart disease，CHD)是嚴重威脅人體健康和生命的常見病，而動脈粥樣硬化又是形成冠心病的重要病理基礎[1]。髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)是在髓系細胞(主要是中性粒細胞和單核細胞)中合成，并且貯存在嗜苯胺藍顆粒中的一種血紅素輔基蛋白酶[2]。MPO通過產生自由基和多種反應性物質[3]，促進斑塊形成和不穩定性增加，加速動脈粥樣硬化進展，進而引起多種并發癥，如急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)[4]。MPO作為一種心血管疾病炎性生物標志物[5]，是該領域的研究熱點之一。目前，MPO檢測方法有酶聯免疫吸附法[6]、免疫比濁法[7]、化學發光法[8]等。雖然這些方法靈敏度與準確度高，但操作過程繁瑣，需專業實驗室和操作技術人員，難以滿足床旁檢測的需求[9]。本研究擬建立一種熒光免疫層析MPO檢測的新方法，此法有靈敏度高、操作簡便、快速等優點[10]，能夠滿足床旁快檢的要求。

1 材料與方法

1.1實驗材料、儀器 羧基熒光微球(Bangs)、硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維棉、吸水紙、PVC板、MPO配對抗體、羊抗鼠IgG、牛血清白蛋白(BSA)、MPO線性標準品、MPO精密性質控品均由河南省生物工程技術研究中心提供，碳二亞胺(EDC)，其他化學試劑均為分析純試劑。本研究臨床樣本由鄭州大學第一附屬醫院提供。

熒光免疫層析讀數儀(杭州峰航科技有限公司)、XYZ三維平面點膜噴金儀(上海金標生物科技有限公司)、臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)、101型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1試紙條的制備 參照文獻[9]試紙條制備方法。(1)MPO抗體-熒光微球的制備：熒光微球通過EDC活化，與MPO抗體偶聯形成復合物，復合物再通過保護液復溶、封閉液封閉等過程，最終制備成MPO抗體-熒光微球以備用。(2)包被與組條：揭去中間粘性貼紙，將NC膜貼入PVC板中部，將稀釋成1.5 mg/ml羊抗鼠IgG、2 mg/ml MPO包被抗體分別作為質控線(C線)和檢測線(T線)，使用XYZ三維平面點膜噴金儀在NC膜均勻劃線(1 μl/cm)，37℃烘干2 h以備用。揭去上、下端兩條粘性貼紙，將吸水墊、已鋪MPO抗體-熒光微球的結合墊、樣品墊依次搭接組裝。將組裝好的PVC板放入物料放置平臺，并切割成寬3.9 mm試紙條，放入鋁箔袋(含干燥劑)中密封4℃保存。

1.2.2檢測 在試紙條樣品墊中間位置滴加70 μl樣品，5 min后將試紙條放置在熒光免疫層析讀數儀檢測，然后在紫外分析儀下觀察。

1.2.3工藝條件優化 (1)EDC量的確定：取15 μl 熒光微球加入0.6 ml 0.05 mol/L pH8.0硼酸鹽緩沖液中，旋渦震蕩混勻；依次加入4 mg/ml EDC各10、20、40、60、80 μl，室溫震蕩活化30 min，按1.2.1方法制備5種條件試紙條，用線性標準品分別加樣檢測。(2)標記蛋白量與標記時間的確定在活化后的微球溶液中，依次加入75、100、125、150 μg MPO標記抗體，按30、60、90、120 min時間分別偶聯。按1.2.1方法制備不同標記蛋白量和標記時間試紙條，用100 ng/ml的質控品對不同條件試紙條重復檢測3條，結果取3次平均T線熒光值。(3)最佳保護液的確定:將偶聯好的免疫微球復合物，分別用4種保護液進行復溶：①0.05 mol/L pH8.0硼酸緩沖液、1%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05%NaN3；②0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液、1%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05%NaN3；③0.05 mol/L pH8.0硼酸緩沖液、0.5%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖，0.05%NaN3；④0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液、0.5%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05%NaN3。按1.2.1方法制備4種條件的試紙條，用100 ng/ml的質控品重復檢測3條，取3次平均T線熒光值并在紫外分析儀下觀察4個條件熒光現象。

2 結果

2.1EDC量的確定 見表1，在加入EDC 160 μg條件下，線性最好，最佳線性范圍3.125～600 ng/ml，R2=0.980 3。

2.2標記蛋白量與標記時間的確定 見表2，隨著蛋白標記量的增加，T線熒光值逐漸上升；隨著標記時間增長，T線熒光值先升后降。標記蛋白量125 μg，標記1.5 h時，T線熒光值最高。最佳標記蛋白量125 μg，標記1.5 h。

表15種EDC量的線性關系

Tab.1LinearrelationshipbetweenfivekindsofEDCquantities

LinearEDC dosage40 μg80 μg160 μg240 μg320 μgLinear range(ng/ml)6.25-4003.125-5003.125-6006.25-5006.25-500R20.943 20.926 40.980 30.904 50.877 9

表2蛋白標記量與標記時間的檢測結果

Tab.2Testingresultsofproteinlabelingandlabelingtime

Proteinlabeling(μg)Labeling time(h)0.511.52757 2387 4828 4448 5321007 4517 5368 4958 4871257 7647 6549 1018 8051507 8328 2348 5788 634

圖1 不同保護液檢測結果Fig.1 Different protective fluid testing resultsNote: 1.Borate buffer+1%T-20；2.Tris-HCl buffer+1%T-20；3.Borate buffer+0.5%T-20；4.Tris-HCl buffer+0.5%T-20.

圖2 紫外分析結果Fig.2 UV analysis testing results

2.3最佳保護液的確定 兩種緩沖液相比，Tris-HCl緩沖液復溶效果最好，Tris-HCl緩沖液T線熒光值比硼酸緩沖液熒光值高(圖1)；通過改變T-20的含量，試紙條上聚集現象明顯減少(圖2)。最終確定4號為最佳保護液。

2.4標準曲線與靈敏度 見圖3，線性范圍在3.125～600 ng/ml，R2=0.984 1。最低檢出限0.9 ng/ml。

圖3 標準曲線Fig.3 Standard curve

圖4 熒光層析法和ELISA法的相關性結果Fig.4 Linear correlation between two methods testing Fluorescence immunochromatography and ELISA

2.5精密度 通過M1=12.5 ng/ml、M2=50 ng/ml、M3=200 ng/ml質控品檢測，批內變異系數分別為6.46%、6.09%、5.42%，批間變異系數分別為9.89%、7.58%、7.37%，均滿足批內小于10%，批間小于15%的要求。

2.6方法學比對 結果見圖4，線性回歸方程為：y=1.016 4x+11.825，R2=0.979 5，表明這兩種檢測方法具有良好的相關性。

3 討論

繼膠體金免疫層析技術(GICA)之后[11]，熒光免疫層析技術因快捷，既可定性、又可定量，成為床旁快檢技術(POCT)領域發展的必然趨勢[12]。通過對本技術系統研究，確定本研究偶聯過程EDC 160 μg，蛋白標記量與偶聯時間為125 μg、1.5 h。在本研究中，發現熒光微球聚集影響因素眾多，其關鍵性問題是解決微球聚集。添加表面活性劑，能夠增加親水性，會影響抗原抗體結合后的流速。表面活性劑在0.2%～2%的濃度范圍內，能夠增強抗原抗體的特異性結合，更助于樣品釋放，從而提高試紙條靈敏度，也能減少試紙條上微球聚集。本研究通過借助調整保護液中的緩沖體系、表面活性劑，減少試紙條免疫微球聚集，為熒光免疫層析技術的完善提供一種參考。本方法與國外ELISA法診斷試劑對比，相關性高，為冠心病的臨床診斷提供一種新的手段，具有較高的臨床應用價值。