文拉法辛對抑郁模型大鼠認知功能及海馬神經元凋亡的作用研究

楊 茜 王 靜 裴雙義

(唐山市工人醫院導管室,唐山063000)

抑郁癥是一種心身疾病,以焦慮、睡眠障礙、食欲變化和缺乏快感為特征,發病率高，治療效果差，嚴重危害人類健康。抑郁癥發病原因復雜，海馬神經元細胞的凋亡或壞死、神經細胞突觸的可塑性受到損害是其可能機制[1]。海馬是非常重要的腦區，在認知能力、學習記憶能力、情感、行為等諸多方面發揮不可替代的作用。多項研究表明，抑郁癥能夠導致患者海馬體積變小，海馬神經元數量變少、樹突結構重建受阻、海馬萎縮，而抗抑郁藥物能夠較好地緩解這一過程[2]。

磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase/serine/threonine kinase,PI3K/AKT)P13K/Akt通路在細胞生長、糖代謝、增殖、核糖體功能、轉錄和凋亡等方面起著關鍵的作用。P13K是一種重要的蛋白激酶，P13K活化后，可進一步磷酸化激活Akt，并調控下游的雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)、半胱天冬酶(Caspase)、B細胞淋巴瘤基因-2/及其相關X蛋白(B cell lymphoma-2/Bcl-2 Associated X protein,Bcl-2/BAX)等多條信號通路的活性，該信號通路被公認為具有很強的促進細胞生長和抗凋亡能力,影響細胞增殖、凋亡及其他生物學行為[3]。

Venlafaxine(文拉法辛)是一種新型的抗抑郁藥，作用于5-羥色胺和去甲腎上腺素,有效地抑制再攝取,同時抑制多巴胺的再攝取,進而改善抑郁患者臨床癥狀。本研究以抑郁模型大鼠為研究對象，觀察文拉法辛對其行為學、認知功能、海馬神經元的形態、結構和凋亡與凋亡蛋白的關系及對PI3K/Akt信號通路相關蛋白的影響，進一步研究文拉法辛抗抑郁的機理，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與材料 雄性SD大鼠100只，SPF級，體重180～200 g，北京維通利華公司采購，恒溫23℃，晝夜節律光照，自由隨意進食。 Venlafaxine(文拉法辛)購自惠氏制藥有限公司。從美國羅氏公司購得TUNEL凋亡試劑盒。尼氏染色試劑盒購自北京雷根生物科技有限公司。PI3K、pAKt、BCL-2、BAX、mTOR、Caspase-3蛋白一抗購自英國Abcam公司。二抗購自中杉金橋有限公司。

1.1.2實驗儀器 自制強迫游泳儀。曠場測驗箱購自美國Med公司。-80℃冰箱購自美國SANYO公司。光學顯微鏡從日本索尼公司購買。Western blot系統是從美國Bio-Rad公司購買。Morris水迷宮設備，購自上海鑫軟科技公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型建立 100只SD雄性大鼠，喂養7 d適應環境后，采取曠場實驗評估，標準水平活動得分40～100分。將符合條件的大鼠隨機分為5組,對照組，模型組和文拉法辛1、2、3組。對照組正常喂養，除行為學測驗外無其他刺激。模型組及文拉法辛1、2、3組采用慢性無法預見性應激(CUMS)刺激聯合孤養方式，喂養21 d，建立抑郁模型[4-6]。CUMS包括8種不同刺激，4℃冰水中游泳，停止供水24 h，停止供食24 h，連續夾尾 1 min，捆綁束縛2 min，懸掛5 min，晝夜逆轉24 h，45℃水溫游泳5 min。每天一種刺激，連續3 d，刺激不重復。造模完成后進行曠場實驗及糖水消耗實驗評估造模是否成功[4-6]。建模成功后，文拉法辛1、2、3組分別腹腔注射文拉法辛5、15、45 mg/(kg·d)，模型組注射鹽水，連續14 d。

1.2.2行為學測定

1.2.2.1曠場實驗 在刺激前、造模后及給藥14 d后，采用ENV-520曠場測驗儀跟蹤大鼠的活動，對自發活動和探索能力進行檢測,分析時間3 min,活動總路程記錄。

1.2.2.2糖水消耗試驗 實驗前大鼠已行糖水適應訓練。在應激刺激前、造模完成后及給藥結束后均進行糖水消耗試驗。停止供水12 h后，各組大鼠按只分別給予1瓶1%蔗糖溶液和1瓶純水，在1 h的自由隨意飲用后,蔗糖水和純水進行稱重，衡量糖水消耗和糖水偏好指數=蔗糖水消耗/總液體消耗×100%。

1.2.2.3強迫游泳實驗 大鼠放置于大水桶中，高50 cm直徑30 cm，水深30 cm， 25℃水溫，預強迫游泳15 min，恢復24 h，強迫游泳5 min，記錄各組大鼠靜止不動狀態的時間，即為浮在水面、停止掙扎或只存在肢體的微小活動確保頭部浮起的時間。

1.2.3水迷宮實驗 使用Morris水迷宮對大鼠認知功能進行評價。水迷宮為恒溫圓柱形水池，池水及池壁顏色均為黑色，分4象限，2象限下面隱蔽平臺距離水表面2 cm，固定位置。將大鼠隨機放入4個象限，分別進入水中，每組大鼠2 min的到達時間進行了記錄，這是逃避潛伏期。如果老鼠不能在2 min 找到隱藏平臺,大鼠放置在平臺15 s，記錄為潛伏期120 s。在第6天,平臺被移走，大鼠進入水中，從先前的4個象限進入水中。計時2 min，大鼠通過平臺象限的時間記錄為空間探索時間。

1.2.4尼氏染色 大鼠灌注固定取海馬，進行低溫冰凍切片，晾干后先用二甲苯進行脫脂，再放入逆行濃度梯度的酒精溶液中進行脫脂，在蒸餾水中浸泡2 min，室溫15 min甲苯胺藍溶液(濃度為1%)染色，然后在蒸餾水中浸泡2 min， 95%乙醇分色，放入依次增加的酒精溶液中進行脫水，用二甲苯溶液進行切片透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察海馬細胞形態變化。

1.2.5TUNEL染色 海馬組織切片后先進行脫蠟，再采用乙醇進行脫水，使用蛋白酶K進行消化，PBS溶液洗滌2次，滴入TUNEL反應液及復合液，采用DAB染色，最后再經蘇木素染色，封片后觀察。隨機選取海馬CA3區的組織切片3張，隨機抽取5個視野，染色呈現為棕褐色的細胞為凋亡陽性細胞，在每個視野范圍內均檢測到棕色陽性細胞，計算數目后除以細胞總數，平均值為細胞凋亡率。

1.2.6Western blot方法檢測 大鼠給藥完成后取材，分離海馬組織，放置于冰上，對組織進行研磨，加入蛋白裂解液，4℃離心30 min，蛋白質定量試劑盒操作定量。取相同量的樣品,進行12%凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉移到PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉過夜，封閉阻斷抗體，一抗稀釋溶液為0.5%BSA溶液，和印跡膜在室溫下孵育2 h，取出用TBST洗膜10 min重復3次，二抗稀釋溶液為0.5%BSA溶液，印跡膜在室溫下孵育2 h后洗滌液TBST 15 min 重復3次，加入ECL試劑，凝膠成像儀觀測和統計分析。

2 結果

2.1文拉法辛對抑郁模型大鼠自發活動的影響 曠場實驗測得對照組、模型組、文拉法辛1、2、3組大鼠刺激前自發活動總路程比較差異無統計學意義(P>0.05)。造模后抑郁模型組及文拉法辛1、2、3組自發活動量明顯低于對照組(P<0.05),差異有統計學意義，抑郁模型成功建立。造模后抑郁模型組及文拉法辛1、2、3組活動總路程比較差異無統計學意義(P>0.05)。給藥14 d后對照組與模型組自發活動路程與給藥前比較差異無統計學意義(P>0.05)。文拉法辛1、2、3組給藥14 d后自發活動較模型組及給藥前顯著增加，且隨著濃度升高而增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2文拉法辛對抑郁模型大鼠糖水消耗試驗的影響 正常對照組，抑郁模型組和文拉法辛1、2、3組

刺激前糖水消耗試驗和糖水偏好指數三組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。造模成功后，抑郁模型組及文拉法辛1、2、3組活動糖水消耗和糖水偏好指數均顯著低于對照組(P<0.05),差異有統計學意義，考慮抑郁模型建模成功。造模后抑郁模型組及文拉法辛組糖水消耗量和糖水偏好指數差異無統計學意義(P>0.05)。給藥14 d后，對照組和模型組糖水消耗量和糖水偏好指數與用藥前比較差異無統計學意義(P>0.05)。給藥14 d后文拉法辛1、2、3組糖水消耗和糖水偏愛指數較給藥前及模型組顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著濃度升高而增加。見表2。

2.3文拉法辛對抑郁模型大鼠強迫游泳不動時間影響 給藥結束后正常對照組、抑郁模型組、文拉法辛組大鼠強迫游泳不動時間分別為(89.1±10.2)s、(138.7±16.6)s和(92.6±10.5)s。對照組強迫游泳不動時間最短，抑郁模型組強迫游泳不動時間長于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較文拉法辛組強迫游泳不動時間縮短，差異有統計學意義(P<0.05)，文拉法辛組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

2.4文拉法辛對抑郁模型大鼠水迷宮實驗結果比較 給藥結束后正常對照組、抑郁模型組、文拉法辛1、2、3組逃避潛伏期分別為(8.7±2.8)s、(21.8±5.0)s、(11.9±2.6)s、(10.8±2.5)s和(10.4±2.7)s，空間探索時間分別為(9.7±3.4)s、(20.6±3.4)s、(12.4±3.9)s、(11.8±3.6)s和(11.4±2.9)s。

表1文拉法辛對抑郁模型大鼠自發活動的影響

Tab.1EffectofVenlafaxineonspontaneousactivityindepressionmodelrats

Note:Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05.

表2文拉法辛對抑郁模型大鼠糖水消耗試驗的影響

Tab.2EffectsofVenlafaxineonsugarwaterconsumptiontestindepressionmodelrats

Note:Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05.

大鼠對照組逃避潛伏期和空間探索時間最短，模型組和文拉法辛1、2、3組逃避潛伏期和空間探索時間均長于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。文拉法辛1、2、3組逃避潛伏期和空間探索時間隨著濃度升高而減少，均短于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.5文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬CA3區神經元形態的影響 正常對照組大鼠海馬CA3神經元細胞層次豐富，排列整齊，包膜完整，形態正常，未見細胞壞死。抑郁模型組大鼠海馬神經元層次變少，細胞萎縮、排列稀疏，胞核變小甚至固縮，壞死細胞多見。文拉法辛1、2、3組海馬神經元細胞層次豐富，細胞形態規則，壞死細胞較少，較抑郁模型組大鼠海馬神經元形態改善顯著。見圖1。

表3各組大鼠給藥后強迫游泳及水迷宮實驗結果比較

Tab.3Comparisonofexperimentalresultsofforcedswimmingandwatermazebyratsineachgroup

Groupsmotionless-time ofswimming by force(s)Escapelatency(s)Spaceexploration time(s)Control89.1±10.28.7±2.89.7±3.4Model138.7±16.61)21.8±5.01)20.6±3.41)Ven 192.6±10.51)2)11.9±2.61)2)12.4±3.91)2)Ven 292.2±11.61)2)10.8±2.51)2)11.8±3.61)2)Ven 391.9±10.71)2)10.4±2.71)2)11.4±2.91)2)

Note:Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

圖1 文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬CA3區尼氏染色(×200)的影響Fig.1 Effect of Venlafaxine on hippocampal CA3 region of depression model rat with Nissl straining(×200)Note: A.Control group；B.Model group；C.Venlafaxine group 1；D.Venlafaxine group 2；E.Venlafaxine group 3.

2.6文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬CA3區神經元凋亡的影響 TUNEL色中棕褐色即為凋亡陽性細胞。正常對照組凋亡細胞數量少見，凋亡率(8.9±1.1)%；抑郁模型組凋亡細胞顯著增加(53.5±3.7)%，與正常對照組相比差異具有顯著統計學意義(P<0.01)；文拉法辛1、2、3組凋亡率分別為(18.6±2.4)%、(16.3±1.7)%和(13.2±1.9)%，隨著文拉法辛濃度增加而降低，與模型組比較，凋亡細胞出現明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2、3。

圖2 文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬CA3區TUNEL染色(×200)的影響Fig.2 Effect of Venlafaxine on hippocampal CA3 region of depression model rat with TUNEL straining(×200)Note: A.Control group；B.Model group；C.Venlafaxine group 1；D.Venlafaxine group 2；E.Venlafaxine group 3.

圖3 文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬神經元TUNEL凋亡率的影響Fig.3 Effects of Venlafaxine on apoptosis rate of hippoca-mpal neurons of depression model ratsNote: Compared with the control group,**.P<0.01；compared with the model group,##.P<0.01.

圖4 文拉法辛對抑郁模型大鼠各蛋白水平的影響Fig.4 Effects of Venlafaxine on levels of protein in depression model rats

2.7文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬PI3K、pAKt、mTOR、BCL-2、BAX、Caspase-3蛋白表達的影響 模型組、文拉法辛1、2、3組與正常組比較，PI3K、pAKt、mTOR、bcl-2的表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，bax和Caspase-3的表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。文拉法辛1、2、3與模型組比較，PI3K、pAKt、mTOR、bcl-2的表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，bax和Caspase-3的表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。且文拉法辛1、2、3組各蛋白的表達均具有濃度依賴性。見圖4。

3 討論

在我們這項研究中，慢性無法預見性應激(CUMS)孤養21 d被用來建立大鼠抑郁模型，模型大鼠的自發活動較前降低(P<0.05)，大鼠出現反應遲鈍、活動減少、不喜飲食、糖水偏好指數和糖水消耗量明顯下降(P<0.05)，提示本研究抑郁模型大鼠造模成功，與其他文獻報道一致[4-6]。文拉法辛能夠抑制腦細胞中去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺的再攝取，可以有效改善抑郁癥狀，是一種廣泛使用的臨床抗抑郁藥[6-8]。給予文拉法辛處理抑郁模型大鼠后，與抑郁模型組比較，大鼠自發活動，糖水偏好指數及糖水消耗量顯著增加，強迫游泳不動時間縮短，提示文拉法辛能夠改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，與其他研究報道結果一致[6,8-11]。

多項研究證實，抑郁患者常常伴有海馬形態的萎縮和認知功能的受損[12,13]。水迷宮能夠檢測大鼠認知功能，本研究通過水迷宮實驗，發現抑郁模型大鼠逃避潛伏期和空間探索時間較正常對照組明顯延長，說明抑郁模型大鼠導致大鼠認知、學習記憶能力的損害。文拉法辛處理后，逃避潛伏期和空間探索時間較模型組明顯縮短，說明文拉法辛能夠改善抑郁模型大鼠的認知功能。

慢性抑郁患者頭顱MRI提示患者大腦區域較正常人縮小，海馬萎縮嚴重，神經元數量變少，尤其以海馬齒狀回和CA3區的神經元細胞損害最為嚴重[14-16]。慢性應激狀態建立抑郁模型大鼠，能夠引起大鼠海馬功能結構的變化，導致海馬神經元的凋亡，出現大腦功能的損害，海馬CA3區是損傷的典型部位，其損傷程度與抑郁行為保持一致[16,17]。本研究發現，抑郁模型大鼠海馬神經元萎縮及壞死較為嚴重，且海馬神經元凋亡率較正常對照組顯著增加，文拉法辛藥物處理后海馬神經元形態規則細胞完整，萎縮及壞死細胞較少，形態結構較模型組改善顯著，且海馬神經元凋亡率較模型組顯著下降，提示文拉法辛能夠減少海馬神經元的凋亡率，對海馬神經元細胞有保護作用。

PI3K/Akt信號通路中活化的P13K激活Akt，信號進一步轉導，Akt激酶能調控下游的mTOR、Caspase、BAX/Bcl-2等多條信號通路的活性，引起級聯反應，參與細胞的生理代謝過程[18]。BAX和BCL-2是常見的促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白， caspase-3是細胞凋亡級聯的關鍵酶,是細胞凋亡級聯的核心,Caspase-3酶的水解活性超細蛋白作用可直接誘導細胞凋亡，并能損傷DNA加速凋亡[3,18-20]。研究顯示，抗抑郁藥能夠影響PI3K/Akt信號通路[3,17,18]。本研究顯示，抑郁模型組與正常組比較，PI3K、pAKt、mTOR、BCL-2表達明顯下降，BAX、Caspase-3表達明顯增加，文拉法辛處理后與抑郁模型組相比能夠顯著提高PI3K、pAKt、mTOR、BCL-2的表達(P<0.05)，顯著降低BAX、Caspase-3表達，提示文拉法辛能夠通過PI3K/Akt信號通路抑制海馬神經元細胞的凋亡。

綜上所述，文拉法辛能夠改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為和認知功能，并且能夠通過PI3K/Akt信號通路改善抑郁模型大鼠的海馬神經元凋亡。