siRNA靶向NRP-1基因沉默經Wnt、ROS及TGF-β1途徑抑制宮頸癌細胞增殖①

李慧敏 王曉霞 武美麗 金莉婭 苗麗娟 孫 禮

(甘肅省婦幼保健院生殖內分泌科，蘭州730050)

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，近些年的發病率上升，且呈現出年輕化的趨勢，給女性的生命健康造成嚴重的威脅[1]。宮頸癌的發生發展是一個多階段、多基因調控的復雜過程，涉及表觀遺傳學和免疫學改變、癌基因的激活和抑癌基因失活等，因此，尋找有效的宮頸癌診療靶點具有重要意義。神經纖毛蛋白(Neuropilin，NRP)是一種細胞膜表面的跨膜糖蛋白，因在神經發育方面的作用而被認識，也因此而得名，有NRP1和NRP2兩個成員，NRP1主要在神經細胞、腫瘤細胞和血管內皮細胞等的細胞膜表面表達，屬于非酪氨酸激酶輔助受體，是VEGF的共受體，能夠與其結合促進血管新生及腫瘤的發展和轉移[2,3]。已有研究顯示，多種惡性腫瘤中NRP1出現過表達，如肺癌、結腸癌、乳腺癌等，其高表達可促進腫瘤的發生發展[4-6]。目前NRP1在宮頸癌中的研究相對較少，有研究顯示，宮頸癌中NRP1的表達升高，其高表達與淋巴結轉移和臨床分期有關[7]，但關于NRP1對宮頸癌生物學特性的影響及機制研究尚未清楚。Wnt信號通路是一類保守的信號通路，與包括宮頸癌在內的多種腫瘤發生發展密切相關，其激活可促進腫瘤發展[8]。本研究通過RNA干擾技術沉默宮頸癌細胞中NRP1的表達，試圖研究其對癌細胞活力、凋亡、免疫抑制因子表達及Wnt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料、試劑和儀器 人正常宮頸細胞Ect1/E6E7 及宮頸癌Hela、CaSki、SiHa、HCC94細胞均購自中科院上海細胞庫；DMEM培養基、雙抗均購自美國Gibco；胰蛋白酶購自南京凱基生物；NRP-1、TGF-β1、Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1抗體均購自美國Abcam；CCK8試劑盒購自DoJINDO；Bradford試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、ECL發光試劑盒均購自碧云天生物；脂質體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen；DCFH-DA購自美國Sigma；酶標儀購自美國Thermo；流式細胞儀購自美國BIO-RAD。

1.2方法

1.2.1細胞培養 Ect1/E6E7、Hela、CaSki、SiHa和HCC94細胞用DMEM培養液(含有10%小牛血清及雙抗)，置于5%體積分數的CO2培養箱中37℃培養。每兩天將細胞培養基更換一次，胰酶消化后傳代。后續實驗選擇生長至對數期的細胞。

1.2.2細胞轉染 NRP-1的特異性干擾序列(NRP-1-siRNA)及無意義siRNA系列(NC-siRNA組)均委托廣州銳博生物設計并合成，通過LipofectamineTM2000進行瞬時轉染。轉染前一天以每孔1 ml細胞懸液(約1×105個細胞)接種CaSki細胞于6孔板，細胞達60%生長密度時，換為無血清和抗生素的培養液，參照LipofectamineTM2000轉染說明將NRP-1-siRNA和NC-siRNA轉染CaSki細胞，轉染濃度為100 nmol/L，并設置空白對照組(Control組)，僅加入脂質體，轉染過程嚴格參照轉染說明，轉染后于5%體積分數的CO2培養箱中37℃培養5～6 h，換為含血清和無抗生素培養液，繼續培養48 h，通過Western blot檢測轉染后的細胞中NRP-1的蛋白表達。

1.2.3Western blot 在生長至對數期的Ect1/E6E7、Hela、CaSki、SiHa和HCC94細胞及轉染NRP-1-siRNA后48 h的CaSki細胞中加入適量的細胞裂解液，置于冰上反應30 min，離心收集總蛋白。Bradford試劑盒測定蛋白濃度；蛋白與上樣緩沖液充分混勻后于100℃變性5 min，加50 μg變性蛋白在每孔道中行SDS-PAGE分離，電泳結束后切下目的膠轉PVDF膜，將轉好的膜在5%濃度的脫脂奶粉中封閉2 h，洗膜，4℃孵育稀釋好的NRP-1、TGF-β1、Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1抗體過夜，洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色，化學發光儀內曝光并保存圖像。

1.2.4CCK8法檢測細胞活力 以每孔中100 μl(1×105ml-1)接種生長至對數期的CaSki細胞于96孔板，常規培養24 h后將NRP-1-siRNA和NC-siRNA轉染CaSki細胞，并設置空白對照組(Control組)，每組均設置5個復孔，于轉染的48 h在每個待測孔中加入CCK8試劑10 μl，培養箱內培養1 h，酶標儀測定450 nm吸光度值(OD值)，以OD值反映細胞活力，可以間接反映出細胞的增殖能力。實驗重復3次。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 細胞凋亡率檢測使用Annexin V-FITC和PI進行熒光染色，通過流式細胞儀檢測。收集轉染48 h的細胞，PBS洗滌細胞，胰酶消化后將細胞懸浮于500 μl的Binding緩沖液中，混勻后加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl 的PI，室溫避光環境孵育10～15 min，上機，流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術檢測ROS含量 PBS洗滌細胞，細胞懸浮于含DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)的無血清培養液中，37℃孵育20 min，以無血清的培養基洗滌細胞，將沒有進入細胞的DCFH-DA去除掉，流式細胞儀檢測熒光強度(激發波長和發射波長分別為488 nm和525 nm)，由于熒光強度與細胞內的ROS水平呈現出正相關，因此可以熒光強度大小反應細胞內ROS的水平。實驗重復3次。

2 結果

2.1NRP-1在宮頸癌細胞表達 以人正常宮頸細胞Ect1/E6E7 為對照細胞，Western blot檢測宮頸癌Hela、CaSki、SiHa、HCC94細胞NRP-1的蛋白表達，結果如圖1所示，Ect1/E6E7、Hela、CaSki、SiHa、HCC94細胞NRP-1的蛋白表達分別為(0.092±0.010)、(0.245±0.032)、(0.473±0.041)、(0.337±0.038)、(0.316±0.033)，NRP-1在宮頸癌細胞的表達均顯著高于在Ect1/E6E7 細胞中的表達(P<0.05)。

2.2NRP-1-siRNA轉染CaSki細胞效果 NRP-1-siRNA轉染CaSki細胞48 h， Western blot檢測轉染后的細胞中NRP-1的蛋白表達，結果如圖2所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組NRP-1的蛋白表達分別為(0.312±0.032)、(0.324±0.036)、(0.090±0.009)，NRP-1-siRNA組NRP-1的表達顯著低于對照組(P<0.05)，而在NC-siRNA組的表達與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 NRP-1在宮頸癌細胞表達Fig.1 NRP-1 expression in cervical cancer cellsNote: A.Western blot was used to detect the expression of NRP-1 in cervical cancer cells;B.The relative expression of NRP-1 protein in cervical cancer cells;compared with Ect1/E6E7 cells,*.P<0.05.

圖2 NRP-1-siRNA轉染CaSki細胞后NRP-1的蛋白表達Fig.2 Protein expression of NRP-1 after NRP-1-siRNA was transfected into CaSki cellsNote: A.The protein expression of NRP-1 in CaSki cells transfected with NRP-1-siRNA were detected by Western blot;B.The relative expression of NRP-1 protein;compared with the Control group,*.P<0.05.

2.3NRP-1-siRNA轉染降低CaSki細胞活力及誘導細胞凋亡 各組細胞活力及凋亡率檢測結果如圖3所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組的OD值分別為(0.683±0.065)、(0.669±0.062)、(0.321±0.037)，凋亡率分別為(2.01±0.32)%、(2.12±0.38)%、(11.83±0.87)%，與對照組比較，NRP-1-siRNA組細胞活力顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

2.4NRP-1-siRNA轉染誘導CaSki細胞ROS產生 通過流式細胞儀檢測各組細胞中相對熒光強度，由于熒光強度與細胞內的ROS水平呈現出正相關，因此可以熒光強度大小反應細胞內ROS的水平，結果如圖4所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組ROS水平分別為(16.6±1.02)、(18.1±1.11)、(34.3±1.85)，與對照組比較，NRP-1-siRNA組ROS水平顯著升高(P<0.05)。

2.5NRP-1-siRNA轉染降低CaSki細胞免疫抑制因子TGF-β1表達 Western blot檢測各組細胞中免疫抑制因子TGF-β1表達，結果如圖5所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組TGF-β1的蛋白表達分別為(0.362±0.042)、(0.374±0.045)、(0.153±0.016)，與對照組比較，NRP-1-siRNA組TGF-β1的表達顯著降低(P<0.05)。

圖3 NRP-1-siRNA轉染對CaSki細胞活力及細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of NRP-1-siRNA transfection on viability and apoptosis in CaSki cellNote: A.The OD value of each cell;B.The results of cell apoptosis detection in each group;C.Cell apoptosis rate in each group;compared with Control group,*.P<0.05.

圖4 NRP-1-siRNA轉染對CaSki細胞ROS含量的影響Fig.4 Effect of NRP-1-siRNA transfection on the content of ROS in CaSki cellsNote: Compared with the Control group,*.P<0.05.

圖5 NRP-1-siRNA轉染對CaSki細胞免疫抑制因子TGF-β1表達的影響Fig.5 Effect of NRP-1-siRNA transfection on the expression of immunosuppressive factor TGF-β1 in CaSki cellNote: A.Western blot was used to detect the protein expression of TGF-β1;B.The relative expression of TGF-β1 protein;compared with the Control group,*.P<0.05.

2.6NRP-1-siRNA轉染下調Wnt信號通路表達 Western blot檢測Wnt信號通路相關蛋白Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1的蛋白表達，結果如圖6所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組Wnt1的蛋白表達分別為(0.756±0.075)、(0.773±0.072)、(0.192±0.023)，β-catenin的蛋白表達分別為(0.342±0.034)、(0.359±0.036)、(0.123±0.015)，Survivin的蛋白表達分別為(0.187±0.021)、(0.177±0.020)、(0.103±0.013)，Cyclin D1的蛋白表達分別為(0.211±0.018)、(0.205±0.019)、(0.148±0.013)，與對照組比較，NRP-1-siRNA組Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。

圖6 NRP-1-siRNA轉染對Wnt信號通路的影響Fig.6 Effect of NRP-1-siRNA transfection on Wnt signaling pathwayNote: A.Western blot was used to detect the expression of Wnt signaling pathway protein;B.The relative expression of Wnt signaling pathway protein;compared with Control group,*.P<0.05.

3 討論

RNA干擾技術是一種能有效沉默基因表達的方法，具有高度特異性、高效性及濃度和時間依賴性等特點，較其他傳統的基因沉默方法有著更多的優勢，目前已成為基因治療、基因功能研究的一個重要工具[9-11]。在基因治療宮頸癌的研究中，采用RNA干擾技術特異的抑制一些原癌基因的表達可有效降低宮頸癌的發生發展[12,13]。NRP-1基因有廣泛的表達，在幾乎人類所有的惡性腫瘤組織中有表達，既可以在腫瘤細胞上直接分布，也可在腫瘤血管內皮細胞上分布，在多種腫瘤中出現過表達，其過表達可增加腫瘤的發生發展，而也有研究發現通過RNA干擾技術抑制NRP-1的表達可降低腫瘤的發生發展[14,15]。乳腺癌中通過RNA干擾技術抑制NRP-1的表達可降低癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡，并提高其對表柔比星的敏感性，而過表達反之；RNA干擾沉默腦膠質瘤中NRP-1的表達后可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和阻滯細胞周期[16]。NRP-1對宮頸癌的影響研究尚未清楚。有研究顯示，宮頸癌中NRP1的表達升高，其高表達與淋巴結轉移與臨床分期有關[7]。因此本試驗旨在研究NRP1對宮頸癌細胞生物學特性的影響。

本研究首先檢測不同宮頸癌細胞中NRP1的表達，發現CaSki細胞中NRP1的表達最高，因此選擇其作為研究對象，通過RNA干擾技術抑制CaSki細胞NRP1的表達，發現NRP1-siRNA組NRP1的表達明顯降低，說明可用于后續實驗研究。CCK8法及流式細胞儀檢測的結果發現，NRP1-siRNA組細胞活力明顯降低，凋亡率升高。人體正常情況下，ROS產生與清除處于動態平衡，而一些病理因素，可打破其平衡，導致氧化應激的出現，多項研究表明，ROS產生與多種腫瘤細胞生長密切相關[17-20]。本研究的結果提示抑制宮頸癌中NRP1的表達可通過提高ROS含量誘導細胞凋亡。Wnt信號通路是一類保守的信號通路，目前Wnt信號經典通路Wnt/β-catenin及下游的靶基因成為研究熱點。當Wnt被過度激活時可引起β-catenin大量積聚在細胞質內，可引起Survivin、Cyclin D1等下游與腫瘤相關靶基因的激活，從而導致癌細胞發生增殖過度，進而引起腫瘤的發生[21,22]。多項研究顯示，宮頸癌、腎癌等多種腫瘤中Wnt信號被激活，可促進其發生發展，而通過Wnt信號通路抑制劑抑制其表達可降低腫瘤的發生發展[23,24]。TGF-β在機體正常發育及腫瘤發生中有重要作用，有研究發現，TGF-β1具有重要的免疫抑制作用，其在宮頸癌中的大量分泌可逃脫免疫反應的攻擊[25]。宮頸癌中TGF-β1的表達升高，Wnt信號通路可通過促進TGF-β的表達而促進腫瘤血管生成，從而促進腫瘤發生發展[26]。本研究結果顯示，抑制宮頸癌NRP1的表達可降低Wnt信號通路Wnt1、β-catenin和下游靶基因Survivin、Cyclin D1及TGF-β1的表達。這提示NRP1可通過下調Wnt信號通路降低宮頸癌的發生發展。

綜上所述，抑制宮頸癌中NRP-1基因表達可降低癌細胞活力，誘導細胞凋亡，降低免疫抑制分子TGF-β1表達，其機制與提高細胞ROS水平和下調Wnt信號通路有關。該研究提示NRP-1可能對宮頸癌的防治具有一定的價值，但需更多的研究及臨床試驗作為支撐。