柴胡皂苷D對人肝癌HepG2細胞系增殖和裸鼠肝癌形成的抑制作用

吳勤祥 李好朝 喬澤強 賈廷印

(河南南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院普通外科二病區,南陽473058)

肝癌是全球六大惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類健康。2012年全球新增肝癌病例78.2萬，肝癌死亡人數約74.5萬[1]。2012年中國新增肝癌病例42.4萬，肝癌死亡人數約32.1萬[2]。可見中國是全球肝癌負擔最為嚴重的地區。到2013年中國肝癌死亡人數約35.8萬，到2015年肝癌死亡人數增加到42.2萬，肝癌是造成中國嚴重疾病負擔的惡性腫瘤之一[3,4]。肝癌給患者和社會帶來了嚴重的負擔。尋找有效的肝癌治療藥物對人類健康事業具有重要意義。柴胡作為一種具有悠久歷史的傳統草藥，來源于柴胡及狹葉柴胡的干燥根，具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗菌、退熱及保肝等功效，在中國、日本、韓國等亞洲國家被廣泛用于流感、發燒、炎癥、瘧疾等疾病的治療[5]。柴胡皂苷D(Saikosaponin-d,SSd)(化學結構式見圖1A)是柴胡的主要活性成分之一，屬于多萜類衍生物。柴胡皂苷D在多種癌癥中都呈現了抗癌的作用，如肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、神經膠質瘤及肝癌等[6]。本文主要目的在于探索柴胡皂苷D對肝癌HepG2細胞增殖凋亡和裸鼠肝癌形成的影響。

1 材料與方法

1.1細胞系及主要試劑 人肝癌細胞系HepG2來源于美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。柴胡皂苷D購自美國Sigma公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司。細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit購自美國BD公司。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)染色試劑盒購自美國羅氏公司。抗Ki67和抗cleaved caspase-3抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與藥物處理 HepG2細胞置于添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養基中，在37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養。細胞增殖到80%左右時，PBS洗滌后用胰酶消化2 min，加入細胞培養液終止消化，1 500 r/min，23℃離心5 min，棄去上清，收集細胞并立即重懸細胞，1∶5 傳代培養。HepG2細胞分為4組：柴胡皂苷D組(0.1、0.5、1 μmol/L處理)，對照組用等量的DMSO處理。

1.2.2CCK-8檢測細胞增殖 收集不同濃度(0、0.1、0.5、1 μmol/L)柴胡皂苷D處理的HepG2細胞，用已經稀釋到10%的CCK-8溶液將各組細胞制成1×106個/ml的細胞懸液，并在37℃培養1～4 h，檢測450 nm處吸光度值計算細胞增殖倍數。

1.2.3流式細胞術分析細胞凋亡 柴胡皂苷D處理細胞48 h后，收集各組HepG2細胞，PBS漂洗后用1×Binding buffer制成1×106個/ml的細胞懸液。再用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色15 min，最后利用流式細胞儀對染色的細胞進行檢測。

1.2.4蛋白印跡 柴胡皂苷D處理細胞24 h后，用PBS清洗待測細胞3次后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解并提取總蛋白，100℃變性5 min。等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，5%的BSA室溫下封閉1 h，加入相應的一抗，4℃過夜孵育，隨后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統計灰度值計算相對表達量。

1.2.5小鼠模型建立及藥物處理 4周齡裸鼠購自中國科學院實驗動物中心。通過皮下注射3×106個HepG2細胞建立肝癌小鼠模型。當腫瘤體積長到100～120 mm3時被認為腫瘤形成，并將裸鼠隨機分為3組：對照組、假手術組和柴胡皂苷D組，每組5只，并開始記錄為實驗的第1天。柴胡皂苷D組進行腹腔注射柴胡皂苷D(20 mg/kg)；假手術組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.6TUNEL染色 頸椎脫臼法處死裸鼠后取肝臟組織用PBS清洗8次，去掉壞死組織及血凝塊，多聚甲醛(4%)在4°C下固定24 h，PBS清洗后用30%、50%和70%的酒精依次清洗。然后進行脫水，再進行石蠟包埋切片。石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后于常溫下用蛋白酶K處理15 min。PBS漂洗后滴加TUNEL反應混合液于標本上，37℃暗盒中反應1 h。PBS漂洗3次晾干后滴加辣根過氧化物酶結合的POD于標本上，37℃暗盒中反應30 min。漂洗后滴加DAB底物，室溫下反應10 min。PBS漂洗后蘇木素復染5 s，自來水沖洗，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明后用中性樹膠進行封片，顯微鏡下觀察拍照，細胞核呈棕色顆粒的為陽性細胞。

1.2.7免疫組織化學染色 首先肝臟組織的石蠟切片經脫蠟再水化后用Triton-100(1%)處理15 min，H2O2(3%)處理15 min。5% 的羊血清封閉30 min，4℃下過夜孵育一抗，第二天加入二抗，37℃孵育30 min。最后進行染色封片。

1.3統計學分析 用SPSS16.0軟件對實驗數據進行統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05認為存在明顯差異，P<0.01認為存在顯著差異，P<0.001認為存在極顯著差異。

2 結果

2.1柴胡皂苷D對HepG2細胞增殖的影響 利用CCK-8檢測HepG2細胞增殖倍數。如圖1B所示，0.1 μmol/L的柴胡皂苷D組細胞增殖倍數與對照組無明顯差異。0.5 μmol/L和1 μmol/L的柴胡皂苷D處理HepG2細胞4 d后，細胞增殖倍數明顯降低(P<0.05)。上述結果說明，中高濃度(0.5 μmol/L和1 μmol/L)的柴胡皂苷D會抑制HepG2細胞增殖。

圖1 柴胡皂苷D化學結構式(A)和CCK-8檢測HepG2細胞增殖(B)Fig.1 Chemical structure of saikosaponin D(A) and proliferation of HepG2 was detected by CCK-8(B)Note: *.P<0.05 vs.control group.

2.2柴胡皂苷D可促進HepG2細胞凋亡 通過流式細胞術分析柴胡皂苷D對HepG2細胞凋亡的影響。Q4象限代表早期凋亡的細胞，Q2象限代表的是晚期凋亡的細胞。由圖2可知，0.1 μmol/L的柴胡皂苷D組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，0.5 μmol/L和1 μmol/L的柴胡皂苷D組細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。以上結果表明，柴胡皂苷D能提高HepG2細胞凋亡。

2.3柴胡皂苷D對細胞增殖和凋亡標記蛋白表達的影響 用蛋白印記檢測HepG2細胞增殖和凋亡標記蛋白Ki67和cleaved caspase-3的表達。圖3顯示，0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的柴胡皂苷D組Ki67表達明顯低于對照組，cleaved caspase-3表達明顯高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，1 μmol/L的柴胡皂苷D組Ki67表達顯著下降，cleaved caspase-3表達顯著升高(P<0.01)。由此可見，柴胡皂苷D可減弱細胞增殖標記蛋白的表達，并增強細胞凋亡標記蛋白的表達。

2.4柴胡皂苷D會抑制裸鼠肝癌腫瘤形成，提高存活率 通過測量肝腫瘤體積及統計裸鼠存活率，分析柴胡皂苷D對裸鼠肝癌形成及存活率的影響。圖4A顯示，假手術組裸鼠腫瘤體積與對照組無明顯差異，柴胡皂苷D組腫瘤體積明顯小于對照組(P<0.05)。由圖4B可知，對照組和假手術組裸鼠存活率無明顯差異。腫瘤形成的21 d之內柴胡皂苷D組裸鼠存活率維持在100%，在腫瘤形成的24 d后存活率急劇降低，約下降30%。上述結果表明，柴胡皂苷D可抑制肝癌腫瘤的生長，提高存活率。

2.5柴胡皂苷D可提高肝癌腫瘤組織細胞凋亡 利用TUNEL染色檢測肝癌腫瘤組織細胞凋亡。如圖5所示，假手術組與對照組腫瘤組織中凋亡小體數目無明顯差異，柴胡皂苷D組凋亡小體數目極顯著地高于對照組(P<0.001)。以上結果說明，柴胡皂苷D會促進肝癌腫瘤組織細胞凋亡。

圖2 流式細胞術檢測HepG2細胞凋亡Fig.2 Apoptosis of HepG2 was measured by flow cytometryNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs.control group.

2.6柴胡皂苷D對肝癌腫瘤組織增殖和凋亡標記蛋白表達的影響 免疫組化檢測肝癌腫瘤組織增殖和凋亡標記蛋白Ki67和cleaved caspase-3的表達。

圖6顯示，對照組和假手術組腫瘤組織Ki67和cleaved caspase-3表達水平無明顯差異。與對照組相比，柴胡皂苷D組腫瘤組織Ki67表達顯著減弱，cleaved caspase-3表達顯著增強(P<0.01)。以上結果說明，柴胡皂苷D可降低腫瘤組織細胞增殖標記蛋白的表達，并提高腫瘤組織細胞凋亡標記蛋白的表達。

圖3 蛋白印跡檢測HepG2細胞增殖和凋亡標記蛋白表達Fig.3 Expression of proliferation and apoptosis related proteins in HepG2 were tested by Western blotNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs.control group.

圖4 腫瘤體積(A)、小鼠存活率(B)檢測和腫瘤照片Fig.4 Tumor volume(A),survival (B) detection and photograph of tumorNote: *.P<0.05 vs.control group.

圖5 TUNEL染色檢測腫瘤組織細胞凋亡Fig.5 Apoptosis of tumors were detected by TUNEL stainingNote: ***.P<0.001 vs.control group.

圖6 免疫組化檢測腫瘤組織增殖凋亡標記蛋白表達Fig.6 Expression of proliferation and apoptosis related proteins in tumors were measured by immunohistochemical stainingNote: **.P<0.01 vs.control group.

3 討論

目前對肝癌的治療可分為早中晚三個時期的治療，每個階段都有不同的治療方法。對還保有肝功能且無門靜脈高壓癥的早期肝癌患者一般選擇手術切除，對重度肝硬化的早期肝癌患者則需要肝移植。中期肝癌患者一般需要進行經動脈栓塞治療或放射性栓塞治療。晚期肝癌患者大部分都不再適合外科手術，現階段晚期癌癥治療手段主要包括靶向藥物索拉菲尼的使用，免疫治療及溶瘤病毒治療等[7]。然而這些方法的療效都十分有限，且常常伴有較大的副作用。據報道，傳統中藥與常規癌癥治療的結合有助于肝癌的治療[8]。目前已經發現大量有利于疾病治療的天然產物。

大量文獻報道了多種植物提取物具有抑制癌細胞增殖的功能。有數據顯示蘆薈花提取物和貓眼草提取物具有降低肝癌HepG2細胞增殖的功效[9,10]。Hu等[11]發現女貞果實提取物可抑制肝癌Bel-7402細胞增殖。據報道來源于縷絲花的異葒草苷處理肝癌HepG2細胞會降低細胞增殖能力[12]。有研究表明柴胡皂苷D可抑制晚期前列腺癌CWR22Rv1細胞增殖[13]。Hu等[14]發現柴胡皂苷D可抑制黑色素瘤A375.S2細胞增殖。據報道在人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中，柴胡皂苷D可抑制細胞增殖[15]。本研究結果顯示，中高濃度(0.5和1 μmol/L)的柴胡皂苷D會抑制肝癌HepG2細胞增殖，降低Ki67的表達。

越來越多的研究表明許多植物提取物都可以誘導癌細胞凋亡。Byambaragchaa等[16]發現雪蓮乙醇提取物會增強肝癌HepG2細胞凋亡，上調cleaved caspase-3表達。有研究發現閉鞘姜甲醇提取物可增強肝癌HepG2細胞凋亡，提高caspase-3活性[17]。據報道芍藥根和丹參根提取物可提高肝癌HepG2和 SMMC-7721細胞凋亡，增強cleaved caspase-3表達[18]。Yao等[19]發現柴胡皂苷D可誘導前列腺癌DU145細胞凋亡，增強cleaved caspase-3表達。有研究表明柴胡皂苷D可提高腎細胞癌細胞凋亡[20]。在膠質瘤細胞U87中，柴胡皂苷D處理可增強細胞凋亡，提升cleaved caspase-3表達[21]。也有報道柴胡皂苷D可促進宮頸癌Hela和乳腺癌MCF-7細胞的細胞凋亡[22]。本文結果顯示，柴胡皂苷D能提高HepG2細胞凋亡，增強cleaved caspase-3表達。

大量研究發現植物提取物可通過抑制腫瘤生長達到抗癌的功效。Huang等[23]通過體內研究顯示異槲皮苷可抑制肝癌腫瘤生長。據報道石榴皮提取物可提高二乙基亞硝胺誘導的肝癌小鼠存活率，抑制腫瘤生長[24]。也有研究表明柴胡皂苷D和阿霉素混合物可降低乳腺癌腫瘤組織的生長速度[25]。柴胡皂苷D可抑制甲狀腺癌腫瘤的生長[26]。本研究結果顯示，柴胡皂苷D可下調肝癌腫瘤組織Ki67表達，抑制腫瘤生長，提高存活率。

許多植物提取物在腫瘤組織細胞凋亡方面也發揮著積極作用。在二乙基亞硝胺和2-乙酰氨基芴誘導的肝癌大鼠中，黃柏提取物可增強腫瘤組織細胞凋亡[27]。在用肝癌細胞H22建立的荷瘤小鼠中，川楝子提取物可增強腫瘤組織細胞凋亡[28]。Cheng等[29]發現澤漆乙酸乙酯提取物可誘導肝癌腫瘤組織細胞凋亡。本文結果表明，柴胡皂苷D會提高腫瘤組織cleaved caspase-3表達，促進腫瘤組織細胞凋亡。

綜上所述，在肝癌HepG2細胞中，柴胡皂苷D處理會抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，下調Ki67表達，增強cleaved caspase-3表達。而且，柴胡皂苷D還可抑制肝癌腫瘤組織生長，提高存活率，綜上所述，柴胡皂苷D具有抑制人肝癌HepG2細胞系增殖和裸鼠肝癌形成的作用。我們下一步計劃將通過體內體外實驗研究柴胡皂苷D對肝癌侵襲和轉移的影響。