miR-34b抑制非小細胞肺癌A549的侵襲和遷移①

郭東明 張 奇 何東升 江躍全 王志強

(重慶大學附屬腫瘤醫院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫院，腫瘤轉移與個體化診治轉化研究重慶市重點實驗室,重慶400030)

肺癌是全球最為嚴重的惡性腫瘤，發病率和死亡率都居癌癥之首。2012年全世界肺癌新增病例180萬，占所有癌癥新增病例的12.9%；肺癌死亡病例160萬，占所有癌癥死亡病例的19.4%[1]。肺癌包括兩種組學亞型：小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中大部分為非小細胞肺癌，約占85%[2]。肺癌的治療是人類醫療衛生系統的重大課題。MicroRNAs (miRs)是一種長度約為22個核苷酸的小型單鏈非編碼RNA分子，在轉錄后水平調控基因表達。各種癌癥中出現了許多異常表達的microRNAs，這些異常表達的microRNAs在致癌和癌癥進展中起著重要作用[3]。大量研究表明在非小細胞肺癌的治療中microRNAs已經成為研究熱點[4,5]。miR-34家族包括miR-34a/b/c三個成員。miR-34b在乳腺癌、骨肉瘤及前列腺癌等癌癥進程中發揮著重要作用[6-8]。據報道miR-34b在非小細胞肺癌組織中低表達，miR-34b表達水平與非小細胞肺癌患者腫瘤的轉移性存在密切聯系[9-11]。但關于miR-34b對非小細胞肺癌侵襲和遷移的調控作用的報道還十分罕見，miR-34b在肺癌中的具體作用還有待進一步研究。本文的主要目的是探究miR-34b對非小細胞肺癌A549侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1細胞系與主要試劑 非小細胞肺癌細胞系A549來源于美國典型培養物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。RPMI1640培養基、胎牛血清和轉染試劑TurboFect Transfection Regent購自賽默飛世爾科技公司。miR-34b mimic和pc-HIF1α過表達載體由上海吉瑪制藥技術有限公司合成提供。RNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM購自大連TaKaRa公司。熒光素酶檢測試劑盒來源于Promega公司。Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司。抗缺氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF1α)抗體，抗基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloprotein 2,MMP-2)抗體，抗Snail抗體和抗血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與轉染 A549細胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養基，并置于37℃，5% CO2的培養箱中培養。當細胞增殖到70%～80%時進行傳代。將A549細胞分為4組：A549 (空對照)組，miR-34b mimic組，pc-HIF1α組和miR-34b mimic+pc-HIF1α組。按照轉染試劑TurboFect Transfection Regent的說明書向A549細胞單獨或同時轉染miR-34b mimic和pc-HIF1α過表達載體。

1.2.2實時定量PCR (Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 首先用RNA提取試劑盒提取總RNA后再反轉成cDNA，然后用下列引物進行PCR，miR-34b上游引物：5′-TGCGTGTCGT-GGAGTC-3′，miR-34b下游引物：5′-GCGAATCACTAACTCCACT-3′。HIF1α上游引物：5′-TTGCTCAT-CAGTTGCCACTTCC-3′，HIF1α下游引物：5′-AGCAATTCATCTGTGCTTTCATGTC-3′。根據SYBR Premix Ex TaqTM說明書進行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.2.3熒光素酶實驗 用洗滌液對待測細胞進行洗滌，棄去洗滌液后在孔中加入1×細胞裂解液將細胞裂解。然后室溫下于振蕩器上振蕩5～10 min，移入離心管中離心，3 000 r/min，5 min，離心后取上清進行發光測定。按照試劑盒說明書和儀器操作說明對待測樣品進行發光值測定。

1.2.4蛋白印跡 首先用PBS清洗待測細胞3次后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜。經5%的BSA封閉1 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育，第二天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統計灰度值計算相對表達量。

1.2.5Transwell檢測細胞侵襲 待測細胞用無血清的培養基制成1×106個/ml的細胞懸液，再將上述細胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，同時在下室中加入含20%胎牛血清的培養基。37℃培養24 h后，用吉姆薩染色液對上室底部細胞進行染色，同時用棉簽除去上室內側的細胞。顯微鏡下觀察并統計細胞數量。

1.2.6劃痕檢測細胞遷移 首先將待測細胞制成1×106個/ml的細胞懸液后加入6孔板中，過夜培養至形成單層細胞。在單層細胞上用10 μl的槍頭劃橫線，PBS洗3次以洗去因劃痕而脫落的細胞。顯微鏡下拍照測量劃痕寬度，培養24 h后再取出拍照測量劃痕寬度。

1.3統計學分析 用SPSS16.0軟件進行統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1轉染miR-34b mimic對肺癌A549細胞miR-34b表達的影響 向肺癌A549細胞中轉染miR-34b mimic后，利用qRT-PCR檢測miR-34b表達。如圖1所示，mimic-scramble組miR-34b表達與對照組差異無統計學意義。miR-34b mimic組miR-34b表達顯著高于對照組(P<0.001)。由此可見，轉染miR-34b mimic可提高肺癌A549細胞miR-34b表達。

2.2轉染miR-34b mimic可降低肺癌A549細胞HIF1α的mRNA水平 生物信息學預測發現miR-34b與HIF1α存在靶向關系后，通過qRT-PCR檢測HIF1α的mRNA水平。由圖2可知，在A549細胞中轉染mimic-scramble不會影響HIF1α的mRNA水平。轉染miR-34b mimic后，A549細胞HIF1α的mRNA水平顯著下降(P<0.001)。上述結果表明，轉染miR-34b mimic可降低肺癌A549細胞HIF1α的mRNA水平。

2.3miR-34b直接靶向HIF1α 利用熒光素酶進一步驗證miR-34b與HIFα的靶向關系。

圖1 qRT-PCR檢測miR-34b表達Fig.1 Expression of miR-34b was detected by qRT-PCRNote: ***.P<0.001 vs.A549 group.

圖2 qRT-PCR檢測HIF1α的mRNA水平Fig.2 mRNA levels of HIF1α were measured by qRT-PCRNote: ***.P<0.001 vs.A549 group.

圖3顯示，在HIF1α野生型細胞中轉染miR-34b mimic后，熒光素酶活性顯著減弱(P<0.01)。但向HIF1α突變型細胞中轉染miR-34b mimic則不會影響熒光素酶的活性。以上結果說明，miR-34b可直接靶向HIF1α。

2.4miR-34b負向調控HIF1α表達 通過蛋白印跡檢測HIF1α的蛋白水平，分析單獨或同時轉染miR-34b mimic和pc-HIF1α對肺癌A549細胞HIF1α蛋白水平的影響。

圖3 熒光素酶驗證miR-34b與HIF1α的靶向關系Fig.3 Targeted relationship of miR-34b and HIF1α was verified by luciferase assasyNote: **.P<0.01 VS.HIF1α wild type cells.

圖4 蛋白印跡檢測HIF1α的蛋白水平Fig.4 Protein levels of HIF1α were tested by Western blotNote: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

圖5Transwell檢測細胞侵襲

Fig.5CellinvasionwasdetectedbyTranswell

Note: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

圖6 劃痕實驗分析細胞遷移Fig.6 Cell migration was tested by wound healingNote: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

如圖4所示，miR-34bmimic組HIF1α蛋白水平顯著低于對照組(P<0.01)。pc-HIF1α組HIF1α蛋白水平顯著高于對照組(P<0.01)。與pc-HIF1α組相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α組HIF1α蛋白水平顯著下降(P<0.01)。由此可見，miR-34b負向調控肺癌A549細胞HIF1α表達。

2.5miR-34b靶向HIF1α減弱細胞侵襲 為分析miR-34b對肺癌A549細胞侵襲的影響，Tanswell檢測各組細胞侵襲。由圖5可知，miR-34b mimic組每個視野下的侵襲細胞數目顯著少于對照組(P<0.01)。pc-HIF1α組每個視野下的侵襲細胞數目顯著多于對照組(P<0.01)。與pc-HIF1α組相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α組每個視野下的侵襲細胞數目顯著變少(P<0.01)。上述結果表明，miR-34b可通過靶向HIF1α減弱肺癌A549細胞侵襲。

2.6miR-34b靶向HIF1α抑制細胞遷移 利用劃痕實驗分析miR-34b對肺癌A549細胞遷移的影響。圖6顯示，miR-34b mimic組劃痕愈合率顯著低于對照組(P<0.01)。pc-HIF1α組劃痕愈合率顯著高于對照組(P<0.01)。與pc-HIF1α組相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α組劃痕愈合率顯著降低(P<0.01)。以上結果說明，miR-34b可通過靶向HIF1α抑制肺癌A549細胞遷移。

圖7 蛋白印跡檢測侵襲和遷移相關蛋白的表達Fig.7 Expression of invasion and migration related proteins was measured by Western blotNote: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

2.7miR-34b靶向HIF1α對細胞運動相關蛋白表達的影響 通過蛋白印跡檢測MMP-2、Snail和VEGF的表達，分析miR-34b對肺癌A549細胞運動相關蛋白表達的影響。如圖7所示，miR-34b mimic組MMP-2、Snail和VEGF相對蛋白水平低于對照組(P<0.01)。pc-HIF1α組MMP-2、Snail和VEGF相對蛋白水平高于對照組(P<0.01)。與pc-HIF1α組相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α組MMP-2、Snail和VEGF相對蛋白水平下降(P<0.01)。由此可見，miR-34b可通過靶向HIF1α抑制A549細胞運動相關蛋白MMP-2、Snail和VEGF的表達。

3 討論

肺癌是中國發病率和死亡率最高的癌癥，中國的肺癌形勢十分嚴峻，2012年中國新增肺癌病例70.48萬，占全世界肺癌病例的39.2%；肺癌死亡病例56.94萬，占全世界肺癌死亡病例的35.6%[12]。而且，中國的肺癌負擔還在不斷增加，2015年中國新增肺癌病例達73.33萬，肺癌死亡病例達61.02萬[13]。目前治療肺癌最為普遍的方法包括外科手術、放療、化療，但這些方法僅對局部癌癥的患者能起到較好的效果，而對已經發生轉移的晚期癌癥患者的治療效果并不理想[14,15]。開發更加有效的治療方法迫在眉睫。隨著分子生物學的發展，靶向治療受到了越來越多的關注。大量研究表明microRNAs在癌癥的靶向治療中具有很大的潛能[16]。

細胞的侵襲能力在癌癥的轉移過程中發揮著重要作用。許多microRNAs具有調控癌細胞侵襲的功能。有數據顯示在A549細胞中miR-137過表達可負向調控PXN表達，降低細胞侵襲[17]。有研究發現miR-675-5p可通過抑制GPR55表達減弱A549細胞侵襲[18]。據報道miR-34a可通過負向調控神經母細胞瘤CD44表達抑制細胞侵襲[19]。有數據顯示miR-34a和miR-34c可直接靶向Fra-1減弱乳腺癌細胞侵襲[20]。另外，在膀胱癌細胞中miR-34a可直接靶向HNF4G抑制細胞侵襲[21]。Garofalo等[22]發現在非小細胞肺癌H1703和Calu-6細胞中，miR-34a和miR-34c可通過降低PDGFR-α/β表達抑制細胞侵襲。本研究結果顯示，在非小細胞肺癌A549中，miR-34b負向調控HIF1α表達，miR-34b可直接靶向HIF1α減弱細胞侵襲。

越來越多的研究表明microRNAs在癌細胞遷移方面也發揮著重要作用。據報道在非小細胞肺癌A549和H157細胞中，miR-153可通過靶向ADAM19減弱細胞遷移[23]。Wang等[24]發現在胃癌細胞中，miR-34a/b/c可通過靶向YY1降低細胞遷移。在食管鱗狀細胞癌中，miR-34a可通過靶向MMP-2/MMP-9/ FNDC3B抑制細胞遷移[25]。另外，miR-34a還可通過負向調控AXL減弱卵巢癌細胞遷移[26]。有研究表明miR-34c-3p過表達可通過抑制eIF4E表達降低A549細胞侵遷移能力[27]。本文結果顯示，miR-34b可通過靶向HIF1α抑制肺癌A549細胞遷移。

本研究表明，在非小細胞肺癌A549中，miR-34b負向調控HIF1α表達，miR-34b可直接靶向HIF1α減弱細胞侵襲和遷移，抑制運動相關蛋白MMP-2、Snail和VEGF的表達。后續研究將通過體內實驗探索miR-34b在肺癌發生發展中的作用。