IL-6在子宮內膜異位患者血清中的表達及其潛在作用機制研究①

趙冬梅 耿旭景 譚 麗 張 丹 項云改 宋玉霞

(鄭州大學第二附屬醫院生殖醫學研究部，鄭州450014)

子宮內膜異位癥(Endometriosis，EMS)是一種常見的婦科疾病，通常表現為子宮腔外存在子宮內膜細胞，子宮內膜異位癥大大增加了醫療費用，就美國而言每年高達220億美元[1]。子宮內膜異位癥的癥狀差別很大，包括痛經、性交痛、非循環性慢性盆腔疼痛以及不孕癥，嚴重影響了患者的生活質量[2]。子宮內膜異位癥大約影響5%的生育年齡婦女健康，常常伴隨著不孕和盆腔疼痛，其中高達50%的患者是不孕的[3]。手術切除異位病灶和/或激素抑制來減少雌激素的產生，是目前治療的金標準，然而上述方法常伴隨著各種副作用及高復發率[4]，因此，確定子宮內膜異位癥發病機制和尋找新的治療策略至關重要。

研究發現，子宮內膜異位癥與機體免疫炎癥反應有關，多種免疫因子、細胞因子、炎癥因子在子宮內膜異位癥患者中異常表達[5,6]。IL-6由巨噬細胞和上皮細胞分泌，參與機體免疫反應、腫瘤進展、組織修復等過程[7]。最近研究發現，子宮內膜異位患者腹腔液和血清中IL-6表達均明顯升高，且隨著子宮內膜異位癥分期增加，患者腹腔液、血清IL-6水平呈明顯上升趨勢；提示IL-6 可能參與子宮內膜異位的發生發展過程。此外，IL-6可促進淋巴細胞增殖活化，引發機體自身免疫炎癥反應導致免疫損傷；IL-6還可促進子宮內膜上皮細胞增殖，最終導致子宮內膜異位發生[7]。然而，IL-6在子宮內膜異位中促進上皮細胞增殖、上皮間質轉化的潛在機制仍未完全闡明。

本研究檢測了IL-6在子宮內膜異位患者血清中表達及其對原代培養子宮內膜異位癥患者上皮細胞增殖及上皮間質轉化的影響，同時檢測了其可能作用通路蛋白表達變化，并用免疫組化在病理樣本中進行驗證，進一步揭示了IL-6促進子宮內膜異位發生進展的潛在機制，為臨床診斷治療提供了新思路。

1 資料與方法

1.1資料 收集2014年6月～2017年1月間，鄭州大學第二附屬醫院腹腔鏡手術切除的卵巢子宮內膜異位囊腫(又稱卵巢巧克力囊腫)臨床樣本共111例，上述子宮內膜異位標本均經過至少2位病理科醫生診斷，且無其他重大內科疾病及接受激素治療，另選取64例生殖中心對不孕患者原發不孕或內膜回聲不均患者行內膜搔刮術獲取的內膜組織作為對照。患者年齡在18～45歲間，且本研究已獲得所有患者知情同意及鄭州大學第二附屬醫院醫學倫理委員會同意，所有實驗操作均按照相關的指導方針和規定進行。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將獲取的手術切除子宮內膜組織迅速運至無菌操作臺中，用無菌Hank′s緩沖液(HBSS)(Hyclone，美國)洗滌3次，無菌剪刀剪碎并用0.03%的膠原酶Ⅳ(Sigma，美國)于細胞培養箱中消化40 min。取出用無菌篩網(Thermo Fisher Scientific，美國)過濾懸液，將未被消化完全的組織塊分離出來，將細胞懸液進行離心，重懸進行選擇性接觸來純化子宮內膜上皮細胞。將純化的細胞用含10%胎牛血清(Gibco，美國)、1%青鏈霉素(Gibco，美國)和2 μg/ml氟康唑(BD，美國)的DMEM/F12培養液(Gibco，美國)重懸，并置于37℃、5% CO2細胞培養箱(Thermo Fisher Scientific，美國)中培養，待細胞達到80%～90%融合度時進行后續實驗。

1.2.2細胞因子IL-6檢測 收集患者空腹靜脈5 ml，3 000 r/min離心10 min取上清，并置于-80℃保存待測。利用雙抗體夾心ELISA法(R&D systems，美國)按照試劑盒操作步驟進行檢測，將得到的數據根據標準曲線回歸計算IL-6血清濃度。

1.2.3細胞增殖檢測 使用MTT法檢測細胞增殖能力，取5×103個細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后，分別于24、48、72 h將20 μl的5 mg/ml的MTT(Sigma，美國)溶液加到各孔中，將細胞繼續于細胞培養箱中孵育4 h，取出棄上清，每孔加入150 μl的DMSO(生工生物，上海)并在全波長酶標儀上振蕩10 min，檢測490 nm處各孔吸光度值，參考波長為570 nm。

1.2.4細胞侵襲遷移實驗 使用Transwell 小室(BD，美國)檢測細胞侵襲遷移能力變化，預鋪基質膠的Transwell小室用于檢測細胞侵襲能力變化，使用前用無菌PBS或無血清培養基水化30 min，而無基質膠的Transwell小室用于檢測細胞遷移能力變化。取5×104個細胞用無血清培養基中重懸并接種至Transwell的上室中，下室加含10%胎牛血清完全培養基，在細胞培養箱中孵育48 h后，棉球擦去上室未穿膜細胞，用結晶紫(Solarbio，美國)染穿過膜的細胞，顯微鏡下觀察并計數。

1.2.5Western blot檢測 用添加蛋白酶抑制劑(Roche，美國)和磷酸酶抑制劑(Sigma，美國)的RIPA裂解液(全式金，北京)裂解細胞，4℃、12 000 r/min離心10 min取上清，BCA法(全式金，北京)測蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳分離總蛋白(20 μg)并轉移到聚偏二氯乙烯膜(Millipore，德國)上，用0.5%的脫脂牛奶封閉膜，并用p-STAT3、STAT3、BCL6和β-actin(CST，美國)一抗孵育，用過ECL發光液(Millipore，德國)進行顯影，并用Image J軟件測定條帶強度，β-actin做內參進行標準化。

1.2.6免疫組化 按照先前文獻所述進行免疫組織化學分析[8]。用含10%血清的PBS封閉子宮內膜組織石蠟切片，并用抗BCL6(CST，美國)進行孵育，然后將切片與偶聯辣根過氧化物酶的二抗(福州邁新)一起溫育，用DAB試劑盒(福州邁新)檢測免疫反應性并用蘇木精復染，顯微鏡觀察并用半定量分級系統(H-score)比較免疫組化染色強度。

2 結果

2.1IL-6在子宮內膜異位患者血清中的表達 子宮內膜異位癥是一種慢性炎癥疾病，為了更好地了解子宮內膜異位癥患者的炎癥狀態，我們使用ELISA測量了患有和不患有子宮內膜異位癥的婦女血清中IL-6炎性細胞因子表達，研究結果顯示，與不患有子宮內膜異位癥的對照組相比，子宮內膜異位癥患者血清IL-6水平明顯升高(0.97±1.07、2.29±1.47，t=6.285,P<0.01)(圖1)。

2.2IL-6 對子宮內膜上皮細胞增殖影響 通過原代培養的子宮內膜異位癥腺上皮細胞成團生長，呈上皮樣。用不同濃度的IL-6(0、5、10、20、40 ng/ml)處理細胞，MTT檢測其對細胞增殖的影響，結果發現，與IL-6(0 ng/ml)組相比，IL-6 可呈濃度依賴性地促進細胞增殖(0.24±0.02、0.36±0.01、0.53±0.04、0.70±0.04、0.72±0.04，F=124.528，P=0.000)，而20 ng/ml組與40 ng/ml組之間差異無統計學意義(P>0.05，圖2)，故后續研究選擇 20 ng/ml 濃度IL-6進行實驗研究。

2.3IL-6誘導子宮內膜上皮細胞上皮間質轉化子宮內膜異位癥通常在卵巢和腹膜上發現子宮外腺體和間質的存在，上皮間質轉化在這一過程中扮演者重要角色，利用Western blot檢測上皮間質標記物，發現與0 ng/ml組相比，20 ng/ml的IL-6處理細胞后，其上皮標記物E-cadherin表達明顯降低(t1=7.405，P1<0.01)，間質標記物vimentin和Snail表達顯著增加(t2=9.032，P2<0.01；t3=9.279，P3<0.01)(圖3、表1)。

圖1 IL-6在子宮內膜異位患者血清中的表達Fig.1 Expression of IL-6 in serum of patients with endometriosisNote: *.P<0.01 compared with Control group.

圖2 IL-6對子宮內膜上皮細胞增殖的影響Fig.2 Effect of IL-6 on proliferation of endometrial epithelial cellsNote: *.P<0.05 compared with IL-6 (0 ng/ml) group；#.P<0.05 compared with IL-6 (5 ng/ml) group.Compared with the IL-6 (10 ng/ml) group,△.P<0.05.

由此可知，IL-6可誘導子宮內膜上皮細胞發生上皮間質轉化。

2.4IL-6 對子宮內膜上皮細胞侵襲遷移的影響 IL-6可誘導子宮內膜上皮細胞發生上皮間質轉化，故利用Transwell實驗檢測其對細胞侵襲遷移能力的影響，實驗發現與0 ng/ml組相比，20 ng/ml的IL-6處理后，細胞侵襲能力和遷移能力均顯著降低(99.6±13.7、154.3±18.6，t1=4.101，P1<0.05；102.4±12.3、196.5±18.2，t2=7.420，P2<0.01)(圖4)。由此可知，IL-6可增強子宮內膜上皮細胞侵襲遷移能力。

2.5IL-6 對子宮內膜上皮細胞STAT3/BCL6通路影響 有研究發現，BCL6可被IL-6等炎癥因子及STAT3刺激上調[9]，故利用Western blot檢測IL-6處理子宮內膜上皮細胞后BCL6、 STAT3、 p-STAT3蛋白表達。

圖3 IL-6處理后上皮間質標記物的表達Fig.3 Expression of epithelial mesenchymal markers after IL-6 treatment

GroupsProtein levelsE-cadherinvimentinSnail0 ng/ml0.953±0.0810.324±0.0210.168±0.00920 ng/ml0.532±0.0561)1.021±0.1321)0.456±0.0531)

Note:1)P<0.01 vs 0 ng/ml group.

圖4 IL-6對細胞侵襲遷移能力影響Fig.4 Effect of IL-6 on cell invasion and migrationNote: *.P<0.05 compared to 0 ng/ml group.

圖5 IL-6處理細胞后STAT3/BCL6通路蛋白表達Fig.5 Expression of STAT3/BCL6 pathway proteins after IL-6 treatment

Western blot檢測發現，與0 ng/ml組相比，20 ng/ml和40 ng/ml的IL-6處理細胞后，細胞中p-STAT3、BCL6表達均顯著增加，STAT3表達無明顯變化；與20 ng/ml組相比，40 ng/ml的IL-6處理細胞后細胞中p-STAT3、BCL6、STAT3表達無統計學差異(圖5，表2)。由此可知，IL-6可誘導細胞中STAT3通路激活上調BCL6表達。

2.6BCL6在子宮內膜異位組織中的表達 為進一步驗證IL-6可誘導子宮內膜上皮細胞中STAT3/BCL6通路激活，我們利用免疫組化法檢測了BCL6在子宮內膜異位組織中的表達，結果發現，與Control組相比，子宮內膜異位組織中BCL6顯著高表達(32.12±22.25、167.27±90.04，t=15.352，P<0.01)。由此推測，在子宮內膜異位患者中IL-6高表達可能通過誘導BCL6表達促進疾病進展，見圖6。

3 討論

子宮內膜異位癥主要指子宮內膜腺體及間質組織異位至子宮內膜外引發的育齡期婦女常見婦科疾病，通常以異位至宮骶韌帶、卵巢部位為主[10,11]。臨床癥狀常常表現為盆腔疼痛、黏連、不孕，異位組織細胞與惡性癌細胞一樣，具有惡性增殖、侵襲轉移特性[12]。

GroupsRelative levels of proteinp-STAT3STAT3BCL60 ng/ml group0.301±0.0211.356±0.1210.065±0.0085 ng/ml group0.306±0.0241.321±0.1320.264±0.02110 ng/ml group0.291±0.0191.345±0.1060.879±0.09420 ng/ml group1.231±0.1351)1.301±0.1161.297±0.1351)40 ng/ml group1.138±0.1071)1.312±0.1241.246±0.1181)F114.0830.109114.542P0.0000.9770.000

Note:1)P<0.01 compared to the 0 ng/ml group.

圖6 BCL6在子宮內膜異位患者組織中的表達Fig.6 Expression of BCL6 in endometriotic tissueNote: *.P<0.01 compared with Control group.

迄今為止，對于子宮內膜異位癥發生進展機制尚未明確，異位種植學說是目前公認的理論機制，而近年來大量臨床研究表明，多種免疫炎癥反應有關的細胞因子、炎癥因子參與了子宮內膜異位病灶形成，但其中潛在作用機制仍未闡明[13,14]。

IL-6是一種由單核巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞、滋養層細胞等分泌的細胞因子，參與機體的免疫炎癥反應和組織修復過程，研究表明其高表達與盆腔局部黏連及輸卵管損傷有關[15,16]。此外，IL-6還參與炎癥瘢痕形成，刺激輸卵管成纖維細胞增生進而導致輸卵管阻塞引起不孕癥發生[13]。許多研究表明，與無子宮內膜異位癥相比，子宮內膜異位患者血清中IL-6明顯增高，但其作用機制仍不清楚。有研究認為IL-6可刺激P450芳香酶表達，導致異位內膜發生種植，其在卵泡中的表達也會相應增高，引起卵泡發育不良，從而導致不孕癥[13,17]。在本研究中發現子宮內膜異位患者血清中IL-6表達顯著增加，且利用不同濃度IL-6處理原代子宮內膜異位上皮細胞可呈濃度依賴促進細胞增殖，其中20 ng/ml 最明顯，同時也可誘導細胞發生上皮間質轉化，促進細胞侵襲遷移。

BCL6是轉錄抑制因子，是B細胞發育和腫瘤發生所必需的[18]。BCL6由6個Krüppel型鋅結構域和一個能夠結合包括干擾素調節因子(IRF)4和BCL6相關鋅指蛋白(BAZF)在內的BTB/POZ結構域組成；BCL6是人類原癌基因之一，且可通過抑制諸如p53和p30019基因表達來促進細胞增殖；BCL6的DNA結合位點[TTCCT(A/C)GAA]與信號轉導和轉錄激活因子(STAT)類似，BCL6可通過STAT因子結合位點抑制轉錄，進而抑制細胞因子誘導的轉錄[3]。此外，BCL6可被STAT3誘導上調[19]。與無子宮內膜異位患者相比，子宮內膜異位癥患者的異位子宮內膜中STAT3信號異常激活[8]。最近有研究報道，BCL6在子宮內膜異位癥患者的月經周期分泌期異位組織中高表達[20]。故我們猜想IL-6可能通過激活STAT3/BCL6通路發揮功能。通過Western blot檢測發現，隨著IL-6濃度增加，細胞中p-STAT3、BCL6表達逐漸升高，同時我們利用免疫組化發現BCL6在子宮內膜異位癥標本中高表達，提示IL-6可激活STAT3/BCL6信號轉導在子宮內膜異位中發揮作用。

綜上所述，本研究證實了IL-6、BCL6在子宮內膜異位患者血清和組織標本中高表達，且隨著IL-6濃度增加可呈劑量依賴地促進子宮內膜異位上皮細胞中STAT3/BCL6通路激活，進而促進細胞增殖及上皮間質轉化過程，進一步揭示了IL-6促進子宮內膜異位發生進展的潛在機制，為臨床診斷治療提供了新思路。