除草劑阿特拉津的免疫毒性及其對(duì)大鼠免疫功能的影響

趙 菁，劉 劍，張 敏，吳 珊，趙本正，陳俊宇，金延澤

(1．延邊大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 延吉133000；2．吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長春 130041； 3．吉林大學(xué)第二醫(yī)院病理科，吉林 長春 130041)

阿特拉津(atrazine, ATR)是世界上使用最廣泛的除草劑之一[1]，在土壤和地表水中持續(xù)存在并具有生物蓄積作用，可能對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅[2]。免疫系統(tǒng)有識(shí)別自己和異己的功能，當(dāng)某些因素導(dǎo)致機(jī)體免疫功能失調(diào)時(shí)，常會(huì)誘發(fā)各種疾病。已有研究[3-4]表明：長時(shí)間暴露于ATR的魚類及兩棲動(dòng)物免疫功能受到抑制。Nikolay等[5]研究顯示:接觸 ATR 14 d后C57BL/6成年小鼠的胸腺質(zhì)量和脾質(zhì)量減少，構(gòu)成細(xì)胞持續(xù)減少。流行病學(xué)研究[6]顯示：ATR暴露與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可能是生殖系統(tǒng)腫瘤的危險(xiǎn)因子。目前關(guān)于ATR亞急性暴露對(duì)大鼠免疫功能的影響尚需進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)通過探討ATR對(duì)健康大鼠免疫功能的影響，從免疫學(xué)角度闡明ATR導(dǎo)致機(jī)體損傷的機(jī)制，從而為全面評(píng)價(jià)ATR毒性效應(yīng)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 4周齡Wistar雌性大鼠32只，購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào)：201600014675)，飼養(yǎng)于恒定溫度(22℃～25℃)、恒定濕度(40%～50%)環(huán)境中，標(biāo)準(zhǔn)飼料和水供動(dòng)物自由食用。ATR(純度為98.99%，以橄欖油溶解)和刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)購于美國Sigma公司，RPMI 1640和胎牛血清購自美國Gibco公司，白細(xì)胞介素1(IL-1)和白細(xì)胞介素6 (IL-6)酶聯(lián)免疫試劑盒購于美國R&D公司，CD3和CD8熒光標(biāo)記抗體購于美國Ebioscience公司，以橄欖油溶解ATR并制備0.5 、2.5和12.5 g·L-1ATR溶液(4℃條件下最多保存1周)。BIO-RAD550酶標(biāo)儀購于美國Biorad公司，YZ-875超凈工作臺(tái)購于蘇州凈化設(shè)備廠，自動(dòng)CO2恒溫培養(yǎng)箱購于日本ANYO公司，101A-2電熱鼓風(fēng)干燥箱購于上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠，ss-245自動(dòng)高壓蒸氣消毒器購于日本SONY公司。

1.2 動(dòng)物分組和處理 32只Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。對(duì)照組大鼠以等體積橄欖油灌胃，低、中、高劑量ATR組大鼠分別給予5、25和125 mg·kg-1ATR灌胃，每日1次，連續(xù)給藥28 d，第29天處死各組大鼠，取血及脾臟備用。

1.3 各組大鼠體質(zhì)量和脾質(zhì)量的測(cè)定 大鼠于ATR開始給藥當(dāng)天和其后每7天稱體質(zhì)量，第29天處死大鼠，脾臟無菌稱質(zhì)量，計(jì)算脾指數(shù)。脾指數(shù)=脾質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4 脾單細(xì)胞懸液的制備 無菌取各組大鼠的脾組織，剪碎，置于無菌尼龍網(wǎng)上，滴入RPMI 1640完全培養(yǎng)液，輕輕研磨，采用400 μm不銹鋼網(wǎng)去除細(xì)胞碎片。采用低滲緩沖溶液裂解紅細(xì)胞，以淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法(400 g、20 min)分離脾淋巴細(xì)胞，PBS洗滌并重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基(含有10%FBS、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素和2 mmol·L-1L-谷氨酰胺)中，采用臺(tái)盼藍(lán)排除法檢測(cè)細(xì)胞活力，當(dāng)細(xì)胞活力>95%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 HE染色檢測(cè)各組大鼠脾組織病理形態(tài)表現(xiàn) 收集脾臟，固定于10%甲醛緩沖液中，石蠟包埋，然后切片。切片采用蘇木精溶素染色用于組織學(xué)評(píng)估和鏡檢。

1.6 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度至2×107mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)孔更換為含40 mg·L-1ConA的RPMI 1460培養(yǎng)液，對(duì)照孔更換為RPMI 1640培養(yǎng)液，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，置于37℃、5%CO2恒溫孵箱中無菌培養(yǎng)48 h。于分光光度儀490 nm處讀取吸光度(A)值，計(jì)算脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值×100%。

1.7 各組大鼠NK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè) 如上所述制備來自小鼠脾臟的效應(yīng)細(xì)胞。NK細(xì)胞對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞(即YAC-1細(xì)胞)敏感，因此采用YAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞。將1×105L-1YAC-1細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞分別加入96孔板中。孵育48 h后采用分光光度儀于490 nm處讀取A值，計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性。NK細(xì)胞殺傷活性=1-(E+T的A值-E的A值)/ T的A值×100%，其中E+T=效 應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的混合物，E=效應(yīng)細(xì)胞，T=靶細(xì)胞。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組大鼠脾細(xì)胞中CD3+和CD8+T 細(xì)胞百分比 脾細(xì)胞重懸于100 μL結(jié)合緩沖液，加入10 μL CD3 PE-Cy5或CD8 PE抗體，37℃孵育15 min后PBS洗滌3次，隨后于流式細(xì)胞儀上測(cè)定，以對(duì)照組為參照，通過CELL Quest 軟件分析并以側(cè)向和正向散射特征定義細(xì)胞亞型，分析 CD3+和CD8+T 細(xì)胞所占百分比。

1.9 ELISA法測(cè)定各組大鼠血清中IL-1和IL-6水平 處死各組大鼠，收集血液，3 000 g×10 min 離心收集血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)定各組大鼠血清中IL-1和IL-6水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量 本實(shí)驗(yàn)中，所有大鼠均存活到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。與對(duì)照組比較，各劑量ATR組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);各劑量ATR組大鼠體質(zhì)量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠脾指數(shù) 與對(duì)照組比較，低和中劑量ATR組大鼠脾指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量ATR組大鼠脾指數(shù)降低(P<0.05);各劑量ATR組大鼠脾指數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量和脾指數(shù)

Group Dose(mg·kg-1)Body weight(m/g)Spleen index[mB/(mg·g-1)]Control 0170.43±19.4333.77±2.15ATR Low dose 5174.00±13.7131.00±2.75 Middle dose25172.57±21.1332.32±2.77 High dose 125159.57±18.91 29.88±3.55*

*P<0.05 compared with control group.

2.3 各組大鼠脾組織病理形態(tài)表現(xiàn) 與對(duì)照組比較，低劑量ATR組大鼠脾組織無明顯變化；中劑量ATR組大鼠脾組織生發(fā)中心略減少；高劑量ATR組大鼠脾組織呈現(xiàn)明顯退行性變，生發(fā)中心消失，白髓減少，紅髓充血。說明高劑量ATR組大鼠脾臟產(chǎn)生了毒性反應(yīng)。見圖1(插頁三)。

2.4 各組大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 與對(duì)照組比較，低和中劑量ATR組大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高劑量ATR組大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.5 各組大鼠NK細(xì)胞殺傷活性 與對(duì)照組比較，各劑量ATR組大鼠脾細(xì)胞中NK細(xì)胞殺傷活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.6 各組大鼠脾細(xì)胞中CD3+和CD8+T細(xì)胞百分比 與對(duì)照組比較，低和中劑量ATR組大鼠脾細(xì)胞CD3+和CD8+T細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量ATR組大鼠脾細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分比降低(P<0.05)；各劑量ATR組大鼠脾細(xì)胞CD3+和CD8+T細(xì)胞亞群百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠脾細(xì)胞中脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、NK細(xì)胞殺傷活性、CD3+和CD8+T細(xì)胞百分比

Group Dose(mg·kg-1)Lymphocyte transformation rateKilling activity of NK cellsCD3+ T cellsCD8+ T cellsControl 01.71±0.1359.67±5.1810.34±1.8911.89±1.90ATR Low dose 51.55±0.3153.39±6.599.31±1.899.47±1.74 Middle dose251.43±0.1653.49±5.578.66±1.469.21±1.55 High dose 1251.39±0.10*49.49±6.34 6.21±1.21* 7.62±1.80*

*P<0.05 compared with control group.

2.7 各組大鼠血清中IL-1和IL-6水平 與對(duì)照組比較，低和中劑量ATR組大鼠血清中IL-1和IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量ATR組大鼠血清中IL-1和IL-6水平升高(P<0.05)；各劑量ATR組大鼠血清中IL-1和IL-6水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1和IL-6水平

Group Dose(mg·kg-1)IL-1 IL-6Control 0660.06±127.86378.00±86.09ATR Low dose 5672.84±138.53423.93±42.74 Middle dose25670.51±107.42417.82±27.04 High dose 125754.83±130.31*467.38±37.03*

*P<0.05 compared with control group.

3 討 論

ATR是目前世界上應(yīng)用最廣的除草劑之一，其廣泛應(yīng)用所引起的環(huán)境問題已引起了人們的關(guān)注[7]。盡管目前歐盟已經(jīng)禁止使用ATR，但是中國和美國仍然大量使用ATR[8]。研究[9]顯示：ATR可導(dǎo)致Wistar大鼠運(yùn)動(dòng)減少，自發(fā)性肌肉活動(dòng)和全身僵硬癥。研究[10-14]顯示：長期與ATR接觸會(huì)對(duì)心臟、肺、血液、神經(jīng)及生殖系統(tǒng)造成損傷，甚至導(dǎo)致癌癥。已有研究[15-17]證實(shí)：ATR可引起生物體免疫功能抑制。Chen等[15]研究顯示:ATR對(duì)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫功能具有抑制作用，Zhao 等[16]研究顯示:ATR亞急性暴露影響小鼠脾細(xì)胞功能。Karrowa等[17]發(fā)現(xiàn)ATR可降低雌性B6C3F1小鼠的細(xì)胞免疫及機(jī)體抗病能力。Nikolay等[5]發(fā)現(xiàn)：C57BL/6成年小鼠連續(xù)暴露于250 mg·kg-1ATR條件下14 d后，脾臟構(gòu)成細(xì)胞持續(xù)減少，樹突狀細(xì)胞的成熟被抑制，胸腺中CD4+/CD8+T細(xì)胞受明顯影響。ATR通過抑制脾臟樹突狀細(xì)胞成熟、干擾體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，由此可說明ATR處理后小鼠對(duì)腫瘤的宿主抵抗力減弱的原因[18]。Pinchuk等[19]發(fā)現(xiàn)ATR干擾樹突狀細(xì)胞成熟從而清除組織相容性抗原Ⅰ(MHC-Ⅰ)分子，ATR可能有助于免疫逃避。Karrow等[20]發(fā)現(xiàn)：ATR抑制小鼠胸腺指數(shù)和巨噬細(xì)胞數(shù)，減少脾CD8+細(xì)胞數(shù)和殺傷性細(xì)胞數(shù)，并劑量依賴性地降低小鼠對(duì)B16F10黑色素瘤的宿主抵抗力。可見ATR可能通過免疫抑制降低腫瘤耐受力。

本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，各劑量ATR組中大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高劑量ATR組中大鼠脾指數(shù)降低。HE染色結(jié)果提示：高劑量ATR組大鼠脾臟出現(xiàn)明顯退行性變，具體表現(xiàn)為生發(fā)中心消失，白髓減少，紅髓充血，說明125 mg·kg-1ATR組可對(duì)大鼠脾臟產(chǎn)生毒性反應(yīng)。

CD3+T淋巴細(xì)胞是外周血中代表成熟T淋巴細(xì)胞的標(biāo)志物之一，本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，高劑量ATR組大鼠脾細(xì)胞中CD3+和CD8+T細(xì)胞百分比降低，提示ATR可影響脾臟中T淋巴細(xì)胞亞群的分布，減少CD3+T淋巴細(xì)胞的亞群百分比，破壞效應(yīng)T淋巴細(xì)胞亞群的構(gòu)成平衡和細(xì)胞免疫功能的穩(wěn)定。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率是反映機(jī)體細(xì)胞免疫的基本指標(biāo)[21]，本實(shí)驗(yàn)中大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，高劑量ATR組大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低，提示ATR有抑制T細(xì)胞免疫功能的作用。以上改變可能有利于腫瘤免疫耐受的形成，降低免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤免疫的應(yīng)答。Lee等[22]發(fā)現(xiàn)：ATR促使脾臟CD3+T細(xì)胞亞群減少，而CD19+B淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞未受影響，并進(jìn)一步探討其機(jī)制發(fā)現(xiàn)ATR觸發(fā)了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的激活和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(caspase-8)和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase， PARP)的裂解，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡。

白細(xì)胞介素是由白細(xì)胞和其他細(xì)胞產(chǎn)生，在細(xì)胞間發(fā)揮作用的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是監(jiān)測(cè)動(dòng)物和人類免疫系統(tǒng)的一個(gè)敏感指標(biāo)，Xang等[23]發(fā)現(xiàn)：將幼年鯉魚暴露于高濃度ATR下，其脾組織中IL-1表達(dá)水平明顯升高。本研究結(jié)果顯示：ATR暴露后，與對(duì)照組比較，高劑量ATR組大鼠血清中IL-1和IL-6水平均升高。IL-1的分泌可刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，IL-6過度表達(dá)與腫瘤進(jìn)展失調(diào)相關(guān)，其機(jī)制與多種信號(hào)通路特別是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Stat3)信號(hào)通路相關(guān)。研究[24]顯示：患者血清中IL-6水平升高與各種癌癥(如多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌)相關(guān)，且與患者生存期縮短有關(guān)。因此ATR可能通過提高血清中IL-1水平，促進(jìn)IL-6分泌，進(jìn)而通過IL-6激活多信號(hào)通路，最終對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用。

綜上所述，ATR作為一種環(huán)境污染物，具有脾臟毒性，能夠降低淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，減少CD3+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量，可能有利于腫瘤免疫耐受的形成進(jìn)而影響機(jī)體的抗腫瘤能力；同時(shí)ATR通過提高IL-1水平，促進(jìn)IL-6分泌，進(jìn)而激活多條信號(hào)通路，從而對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。因此ATR的免疫毒性應(yīng)該引起足夠的重視。