聚丙交酯-乙交酯微球搭載鹿茸多肽聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)作用及其機(jī)制

龔 慶，宋秋瑩，邱莉晶，黃曉巍，趙文海

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)骨傷科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院耳鼻喉科，吉林 長(zhǎng)春 130117；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)與藥理教研室，吉林 長(zhǎng)春 130117)

坐骨神經(jīng)損傷是一種由外傷引起的臨床常見病，可以造成患者嚴(yán)重殘疾，影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前神經(jīng)自體移植是外周神經(jīng)損傷修復(fù)的最佳方法，然而也有其受限之處，即需要在不同的位置進(jìn)行2次手術(shù)，除了供區(qū)神經(jīng)功能喪失外，也會(huì)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，因此尋找新的治療方案十分必要[2-3]。鹿茸為吉林省名貴中藥材，具有補(bǔ)腎壯陽、生精益血和補(bǔ)髓健骨之功效，鹿茸多肽(velvet antler peptide，VAP)是鹿茸的主要藥效學(xué)物質(zhì)[4-5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是一種具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可以向成骨、軟骨、脂肪和其他類型細(xì)胞分化[6]。二者聯(lián)合應(yīng)用修復(fù)受損外周神經(jīng)尚未見報(bào)道。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，參與調(diào)控蛋白質(zhì)的合成。氧化應(yīng)激、Ca2+紊亂和失衡等均可干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常運(yùn)行，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的適度激活有利于增強(qiáng)細(xì)胞的自我修復(fù)，增加細(xì)胞的存活率，若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活過度或過長(zhǎng)，則會(huì)引起細(xì)胞凋亡[7]。研究[8]表明：外周神經(jīng)損傷的修復(fù)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表達(dá)水平有關(guān)聯(lián)。本研究觀察聚丙交酯-乙交酯(polylactide-glycoli cacid，PLGA)微球搭載的VAP聯(lián)合BMMSCs移植對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的影響，并闡明其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠60只，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量(180±10)g，購于吉林省長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)碼：SCXK(吉)-2016-0003。

1.2 細(xì)胞、藥品、主要試劑和儀器 BMMSCs(中科院上海細(xì)胞庫，貨號(hào)：BNCC340947)。PLGA微球搭載的VAP(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)制備)，全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒和HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：BC3711、PC0020、SW2010、G1120)，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulated protein-78，GRP-78 )、 胱天蛋白酶12(Caspase-12)、GAPDH一抗和HRP二抗(博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：BM4904、PA1815、PA2103、A00227-1、BA1050)。凝膠成像儀(美國(guó)Aplegen公司，型號(hào)：OmegaLum C)。

1.3 模型制備、動(dòng)物分組和給藥方式 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，給予充足的水和食物。60只大鼠隨機(jī)分為4組，即坐骨神經(jīng)橫斷對(duì)照組(對(duì)照組)、VAP微球組(VAP組)、BMMSCs移植組(BMC組)和VAP微球聯(lián)合BMMSCs移植組(VAP-BMC組)。橫斷法[9]復(fù)制大鼠外周神經(jīng)損傷模型，在無菌條件下，將各組大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)在靠近脛骨-腓骨分叉處橫切，在無張力條件下采用9-0號(hào)可吸收神經(jīng)縫合線以神經(jīng)外膜縫合的方法對(duì)端縫合神經(jīng)。神經(jīng)吻合后，置于軟組織中，采用4號(hào)可吸收線縫合傷口。造模7 d后給予藥物治療1次，在對(duì)照組大鼠橫斷坐骨神經(jīng)區(qū)域注射1 mL PBS溶液，VAP組大鼠于相同位置注射1 mL含有15 mg載藥PLGA微球的PBS溶液，BMC組大鼠于相同位置注射1 mL含有1×106個(gè)BMMSCs的PBS溶液，VAP-BMC組大鼠于相同位置注射1 mL含有15 mg載藥PLGA微球和1×106個(gè)BMMSCs的PBS溶液。

1.4 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)估 采用大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)級(jí)量表評(píng)估神經(jīng)功能的恢復(fù)情況，根據(jù)BBB評(píng)估規(guī)則，觀察4 min內(nèi)各組大鼠的運(yùn)動(dòng)情況，當(dāng)無自發(fā)運(yùn)動(dòng)和正常運(yùn)動(dòng)時(shí)，分別給出0和21的分?jǐn)?shù)[10]，達(dá)到14分時(shí)表示肢體可以支撐和四肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。在手術(shù)前記錄1次BBB評(píng)分，以建立基線對(duì)照，手術(shù)后每周1次記錄各組大鼠BBB評(píng)分以評(píng)價(jià)12周內(nèi)各組大鼠外周神經(jīng)的恢復(fù)情況。

1.5 組織標(biāo)本制作和各組大鼠神經(jīng)遠(yuǎn)近端坐骨神經(jīng)軸突直徑的測(cè)定 手術(shù)12周后腹腔注射5%的水合氯醛3 mL對(duì)大鼠實(shí)施安樂死，分離離斷區(qū)域的神經(jīng)組織并照相，取離坐骨神經(jīng)離斷點(diǎn)的近端和遠(yuǎn)端各5 mm內(nèi)的神經(jīng)組織置于10%的中性緩沖甲醛溶液中，將組織包埋于石蠟中，以5 μm的厚度進(jìn)行切片用于組織學(xué)分析。對(duì)分離的神經(jīng)組織進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠坐骨神經(jīng)橫斷面，采用CIAS-1自動(dòng)圖像分析儀測(cè)定各組大鼠神經(jīng)遠(yuǎn)近端坐骨神經(jīng)軸突直徑。

1.6 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中PDI、GRP-78和Caspase-12蛋白表達(dá)水平 將收集的坐骨神經(jīng)組織經(jīng)PBS清洗后，按照北京索萊寶提供的全蛋白提取試劑盒說明書提取各組大鼠坐骨神經(jīng)總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)蛋白濃度為2 g·L-1；將蛋白樣品與等體積2×樣品緩沖液混合，于100 ℃水浴5 min后即刻放入冰浴中冷卻；將樣品加入到放置好SDS-PAGE膠的加樣孔內(nèi)，每孔加樣20 μL，280 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，采用TBST洗滌3次，每次5 min，之后將膜放入5%脫脂奶粉中，水平搖床，室溫下封閉2 h。封閉結(jié)束后，將膜取出，TBST洗滌3次，每次5 min，向洗膜盒中加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)稀釋液，4℃儲(chǔ)存，過夜。加HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000)，水平搖床，室溫封閉2 h。加入ECL發(fā)光液，室溫孵育膜1 min。將膜正面朝上放到凝膠成像儀內(nèi)，照相、記錄結(jié)果。對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度值掃描，對(duì)各目的蛋白進(jìn)行半定量分析。目的蛋白表達(dá)水平=目的條帶灰度值/內(nèi)參照灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠BBB評(píng)分 各組大鼠在手術(shù)后1周表現(xiàn)出一定程度的功能缺陷。與對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)VAP組、BMC組和VAP-BMC組大鼠BBB評(píng)分升高(P<0.01),即大鼠肢體運(yùn)動(dòng)情況明顯改善，以VAP-BMC組大鼠BBB評(píng)分升高最明顯。見圖1和表1。

圖1 不同時(shí)間各組大鼠BBB評(píng)分曲線

Fig.1 Curves of BBB scores of rats in various groups at different time points

2.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)表現(xiàn)和坐骨神經(jīng)軸突直徑 與對(duì)照組比較，VAP組和BMC組大鼠坐骨神經(jīng)纖維更粗，軸突直徑更長(zhǎng)。見圖2(插頁三)。與對(duì)照組[(0.87±0.04) mm]比較，VAP組[(1.22±0.16) mm]、BMC組[(1.42±0.27) mm]和VAP-BMC組[(1.63±0.13) mm]大鼠軸突直徑更長(zhǎng)(P<0.01)。

表1 不同時(shí)間各組大鼠BBB評(píng)分

GroupBBB score(week) 12 3 4 5 6 Control5.10±0.145.11±0.265.22±0.185.26±0.165.91±0.516.31±0.28VAP7.05±0.16*7.09±0.18*7.69±0.45*7.97±0.27*8.21±0.22*8.40±0.25*BMC8.15±0.41*8.29±0.38*8.35±0.36*8.64±0.10*9.22±0.46*9.30±0.62*VAP-BMC8.52±0.36*8.82±0.51*9.03±0.45*9.97±0.26*10.23±0.54*10.60±0.50*GroupBBB score(week) 789101112 Control6.35±0.536.50±0.466.74±0.376.92±0.277.21±0.287.53±0.52VAP8.76±0.27*8.91±0.36*9.31±0.37*9.53±0.55*9.73±0.27*9.93±0.25*BMC9.48±0.18*9.69±0.35*9.83±0.20*10.32±0.50*10.53±0.46*10.73±0.62*VAP-BMC811.05±0.18*11.51±0.37*11.93±0.56*12.32±0.55*12.73±0.46*12.93±0.75*

*P<0.01 compared with control group.

2.3 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中PDI、GRP-78和Caspase-12蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，VAP組、BMC組和VAP-BMC組大鼠坐骨神經(jīng)組織中PDI和Caspase-12蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，VAP-BMC組大鼠坐骨神經(jīng)組織中GRP-78蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見圖3和表2。

3 討 論

外周神經(jīng)損傷是一種臨床常見的外傷性疾病，常規(guī)的手術(shù)移植治療存在一定的弊端，尋找新的治療手段已成為現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)[11]。鹿茸具有“補(bǔ)腎壯陽、生精益血、補(bǔ)髓健骨”的功效，用于腎陽不足、精血虧虛、陽痿滑精、腰脊冷痛和筋骨痿軟等病癥[12]。VAP是鹿茸的主要藥效物質(zhì)，現(xiàn)代研究[13-14]表明：其對(duì)外周神經(jīng)損傷修復(fù)再生具有明顯的促進(jìn)作用，可以加快損傷神經(jīng)變性壞死物質(zhì)的清除，增加對(duì)神經(jīng)再生物質(zhì)的供給，加快軸漿的恢復(fù)，進(jìn)而防止神經(jīng)元壞死，促進(jìn)神經(jīng)損傷早期再生。有研究者[15-16]將VAP和PLGA制成復(fù)合膜結(jié)構(gòu)，包裹損傷的神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)其可以加速神經(jīng)的再生修復(fù)。但臨床應(yīng)用VAP時(shí)，面臨其半衰期較短且易于被體內(nèi)蛋白酶降解的困境。因此，本研究采用藥物緩釋載體(PLGA微球搭載VAP)來提高VAP的生物利用度。BMMSCs可在小鼠周圍神經(jīng)系統(tǒng)部位駐留，并具有保留細(xì)胞形態(tài)的能力，已經(jīng)在外周神經(jīng)損傷修復(fù)中被廣泛應(yīng)用[17-18]。分化的BMMSCs植入外周神經(jīng)斷端時(shí)，可以促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生，其作用機(jī)制與BMMSCs移植促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷中的軸索再生與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)[19-20]。BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)級(jí)量表評(píng)估和HE染色結(jié)果表明：PLGA微球搭載的VAP聯(lián)合BMMSCs可明顯修復(fù)受損的外周神經(jīng)。

Lane 1：Control group；Lane 2：VAP group；Lane 3：BMC group；Lane 4：VAP-BMC group.

圖3 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中PDI、GRP-78和Caspase-12蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of PDI,GRP-78， and Caspase-12 proteins in sciatic nerve tissue of rats in various groups

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中PDI、GRP-78和Caspase-12蛋白表達(dá)水平

GroupPDIGRP-78Caspase-12Control1.16±0.180.82±0.131.38±0.25VAP0.95±0.15*0.79±0.140.70±0.18*BMC0.72±0.20*0.86±0.120.84±0.12*VAP-BMC0.52±0.13*1.19±0.18*0.89±0.17*

*P<0.01 compared with control group.

現(xiàn)代研究[21-24]表明：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)持續(xù)應(yīng)激與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等，而PDI、GRP-78和Caspase-12蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白。PDI蛋白主要位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，發(fā)揮促蛋白氧化還原、異構(gòu)和分子伴侶的作用，參與蛋白的折疊與成熟過程；GRP-78蛋白是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的重要分子伴侶，在應(yīng)激過程中，過表達(dá)的GRP-78蛋白可以與錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白疏水性殘基端以及鈣離子識(shí)別結(jié)合，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的積累并維持鈣離子平衡；Caspase-12蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵因子，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[25-27]。本研究結(jié)果表明：PLGA搭載的VAP與BMMSCs聯(lián)合應(yīng)用可以明顯下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白的表達(dá)水平，在一定程度上抑制持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理功能。

綜上所述，PLGA搭載的VAP及BMMSCs移植可以修復(fù)受損的坐骨神經(jīng)，且二者聯(lián)合應(yīng)用作用更加明顯，其作用機(jī)制可能與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。