高壓氧對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠肝臟組織抗氧化能力和ATP酶代謝的影響

張 萍，張良祥

(齊齊哈爾大學(xué)體育學(xué)院社會(huì)體育基礎(chǔ)理論教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

近年來，隨著競技運(yùn)動(dòng)要求越來越高，為了取得好成績，運(yùn)動(dòng)員在平時(shí)訓(xùn)練時(shí)過度訓(xùn)練的現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生，且呈逐漸升高趨勢[1]，然而，過度訓(xùn)練會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織缺氧而產(chǎn)生大量自由基，不僅不利于運(yùn)動(dòng)成績的提高，而且會(huì)對(duì)多種組織器官產(chǎn)生損傷[2]。肝臟作為機(jī)體重要的貯血和解毒器官，在自由基代謝和抗氧化中發(fā)揮重要作用，有助于延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生[3]。研究[4]顯示：力竭性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可不同程度地?fù)p害肝組織結(jié)構(gòu)及功能。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)作為治療多種疾病的輔助手段，可通過改善機(jī)體氧含量而達(dá)到保護(hù)器官的目的，同時(shí)在抗疲勞等方面發(fā)揮重要作用[5-6]。研究[7]顯示：HBO有助于防止反復(fù)跳躍的特定運(yùn)動(dòng)的肌肉過度疲勞。研究[8]顯示：HBO可保護(hù)疲勞大鼠免受腎臟損傷。但尚未見關(guān)于HBO對(duì)疲勞動(dòng)物模型肝臟影響的報(bào)道。本研究通過制備小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型，觀察HBO干預(yù)對(duì)小鼠肝臟組織抗氧化能力及ATP酶代謝的影響，以期為運(yùn)動(dòng)疲勞相關(guān)機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 健康雄性昆明小鼠30只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005，10周齡，體質(zhì)量(24±2)g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后完成實(shí)驗(yàn)操作。丙二醛(MDA)和過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒均購自上海源葉生物科技有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)和總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，ATP酶試劑盒購自上海星科生物科技有限公司，考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法蛋白濃度測定試劑盒購自上海美季生物技術(shù)有限公司。動(dòng)物高壓氧艙購自上海七零一所楊園高壓氧艙有限公司，透射電鏡購自日本日立公司。

1.2 運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠模型的制備 采用隨機(jī)數(shù)字表將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、疲勞組和HBO干預(yù)組，每組10只。按照參考文獻(xiàn)[9]中介紹的方法制備小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型。建模前，測量3組小鼠體質(zhì)量。將疲勞組和HBO干預(yù)組小鼠尾部按照體質(zhì)量的3%負(fù)重鉛絲，于水深30 cm的Morris水迷宮中游泳，水溫28 ℃，每天下午5:00開始，直至出現(xiàn)力竭現(xiàn)象：頭部全部沒入水中持續(xù)10 s不能浮出，撈出后置于水平面上不能翻正。每天1次，持續(xù)2周，最后一次力竭訓(xùn)練時(shí)，記錄2組小鼠游泳時(shí)間。對(duì)照組小鼠進(jìn)行正常活動(dòng)，每天下午5:00開始進(jìn)行一次無負(fù)重游泳訓(xùn)練，持續(xù)2周。每次力竭訓(xùn)練后，疲勞組小鼠放回籠中，HBO干預(yù)組小鼠立即置于鋪有新鮮鈉石灰的高壓氧艙中，艙內(nèi)壓0.25 MPa，O2濃度>90%，穩(wěn)定吸氧60 min，勻速減壓15 min至常壓后出艙。檢測各組小鼠力竭游泳時(shí)間。

1.3 ELISA法檢測各組小鼠肝臟組織中MDA、CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC水平 于最后一次游泳結(jié)束后，將各組小鼠脫臼處死，快速取肝臟組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干。稱取1.0 g肝臟組織，按1∶9的比例加入生理鹽水，冰浴勻漿，4℃、10 000 r·min-1離心20 min，留取上清，ELISA法檢測各組小鼠肝臟組織中MDA、CAT、SOD、GSH-Px水平和T-AOC，所有操作均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室中并按照試劑盒說明完成。

1.4 電鏡觀察各組小鼠肝臟組織形態(tài)表現(xiàn) 取1 mm×1 mm×1 mm肝臟組織，采用體積分?jǐn)?shù)3%的戊二醛固定組織3 h，鹽酸緩沖液洗滌3次，以1%鋨酸固定，梯度濃度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，雙電子染色后電鏡下觀察肝臟組織形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 各組小鼠肝臟組織中ATP酶活性檢測 取各組小鼠1.0 g肝臟組織，預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干。按1∶9的比例加入冷生理鹽水，用勻漿器制備勻漿液，4℃、3 000 r·min-1離心20 min，留取上清保存于-30℃冰箱以備檢。采用Bradford法蛋白濃度測定試劑盒對(duì)肝組織中總蛋白水平進(jìn)行檢測。采用比色法，根據(jù)ATP酶試劑盒說明書檢測各組小鼠肝臟組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和總ATP酶活性，以每小時(shí)每毫克蛋白分解1個(gè)ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷作為一個(gè)活性單位[10]，即U·mg-1。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠力竭游泳時(shí)間 最后一次力竭訓(xùn)練時(shí)，HBO干預(yù)組小鼠力竭游泳時(shí)間為(75.6±13.3)min，明顯長于疲勞組[(56.9±8.4)min]，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.701，P=0.002)。

2.2 各組小鼠肝臟組織中MDA、CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC水平 與對(duì)照組比較，疲勞組和HBO干預(yù)組小鼠肝臟組織中MDA水平升高(P<0.05)，而CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC水平均降低(P<0.05)；與疲勞組比較，HBO干預(yù)組小鼠肝臟組織中MDA水平降低(P<0.05)，而CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC水平均升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肝臟組織中MDA、CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC水平

GroupMDA[mB/(nmol·mg-1)]CAT[λB/(U·mg-1)]SOD[λB/(U·mg-1)]GSH-Px[λB/(U·mg-1)]T-AOC[λB/(U·mg-1)]Control2.97±0.3419.41±3.6618.27±4.05128.70±15.065.85±0.39Fatigue5.62±0.49*12.11±2.38*11.45±1.81*53.59±5.39*2.27±0.17*HBO interven-tion3.98±0.29*△15.91±2.74*△14.72±3.61*△86.71±5.93*△9.35±0.34*△F119.58115.04610.675146.131262.440P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with fatigue group.

2.3 各組小鼠肝臟組織超微結(jié)構(gòu) 對(duì)照組小鼠肝臟組織細(xì)胞膜完整，核膜光滑、可見核仁，線粒體外膜完整，嵴結(jié)構(gòu)清晰完整，未見明顯異常改變；疲勞組小鼠肝臟組織細(xì)胞出現(xiàn)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，線粒體出現(xiàn)腫脹或濃縮，嵴結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂、變形、融合；HBO干預(yù)組小鼠肝臟組織細(xì)胞膜完整，線粒體改變較疲勞組減輕，嵴結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變亦減輕。見圖1。

A:Control group; B: Fatigue group; C: HBO intervention group.

Fig.1 Ultrastructures of liver tissue of mice in various groups observed by electron microscope (×20 000)

2.4 各組小鼠肝臟組織中ATP酶活性 與對(duì)照組比較，疲勞組和HBO干預(yù)組小鼠肝臟組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和總ATP酶活性均降低(P<0.05)；與疲勞組比較，HBO干預(yù)組小鼠肝臟組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和總ATP酶活性均升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肝臟組織中ATP酶活性

GroupNa+-K+-ATPase activityCa2+-Mg2+-ATPase activityTotal ATPase activityControl2.45±0.170.84±0.081.62±0.09Fatigue1.90±0.08*0.37±0.10*0.99±0.05*HBO intervention2.20±0.12*△0.63±0.10*△1.38±0.12*△F45.46957.770116.347P<0.001<0.001<0.001

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with fatigue group.

3 討 論

正常生理情況下，機(jī)體可將運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的乳酸和氧自由基等有害物質(zhì)有效代謝而不損害健康，但隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加，尤其是長時(shí)間疲勞性運(yùn)動(dòng)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)代謝失衡，使大量的氧自由基等有害物質(zhì)堆積于機(jī)體而損壞健康[11-12]，尤其是對(duì)于競技運(yùn)動(dòng)員，不利于運(yùn)動(dòng)成績的提高，已成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。研究[13-14]顯示：運(yùn)動(dòng)性疲勞與肝臟代謝有密切關(guān)聯(lián)。肝臟不僅是人體內(nèi)重要的能量代謝器官，而且在解毒、貯血等方面發(fā)揮重要作用，可以有效代謝運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的乳酸、氧自由基等有害物質(zhì)[15]，研究[16-17]顯示：運(yùn)動(dòng)性疲勞可破壞肝臟的超微結(jié)構(gòu)，影響肝組織正常代謝功能。本研究采用經(jīng)典的力竭游泳方式制備小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞模型，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，疲勞組小鼠肝臟組織中MDA水平升高，而CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC水平均降低。MDA是脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物，在反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度及自由基對(duì)細(xì)胞破壞程度方面具有重要意義[18]；而CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC則是反映機(jī)體抗氧化能力的主要指標(biāo)，在抗氧化、消除自由基中發(fā)揮重要作用[19]。本研究結(jié)果提示：力竭運(yùn)動(dòng)使小鼠肝臟代謝能力出現(xiàn)異常，抗氧化能力減弱。ATP酶作為生物膜上重要的活性蛋白酶，在能力轉(zhuǎn)化、代謝和信息傳遞中發(fā)揮重要作用，其中，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶對(duì)維持細(xì)胞膜內(nèi)外離子穩(wěn)態(tài)具有重要意義，2種酶活性降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子穩(wěn)定失衡而損傷細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能[20]，本研究結(jié)果顯示：力竭運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和總ATP酶活性均降低；電鏡檢查結(jié)果顯示：力竭運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞出現(xiàn)受損表現(xiàn)，線粒體被破壞。

HBO治療作為近年來臨床上多種疾病輔助治療手段，可快速升高機(jī)體氧及血氧含量，改善組織有氧代謝情況，增加能量生成[21-23]。研究[8]顯示：HBO暴露可減輕疲勞大鼠腎臟損傷。本研究對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)小鼠進(jìn)行HBO干預(yù)后，HBO干預(yù)組小鼠力竭游泳時(shí)間明顯長于疲勞組，說明HBO干預(yù)對(duì)改善力竭小鼠疲勞狀態(tài)有效，具有抗疲勞的作用。本研究結(jié)果顯示：與疲勞組比較，HBO干預(yù)組小鼠肝臟組織中MDA水平降低，而CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC水平均升高，說明HBO干預(yù)可有效提高肝臟抗氧化能力，增加抗氧化酶活性。本研究結(jié)果顯示：HBO干預(yù)組小鼠肝臟組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和總ATP酶活性均升高；電鏡結(jié)果顯示：HBO干預(yù)組小鼠肝臟細(xì)胞破壞程度減輕，線粒體改變減少，進(jìn)一步提示HBO干預(yù)可減少疲勞性運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠肝組織的破壞，這可能與其提高肝臟組織抗氧化能力及ATP酶活性有關(guān)。

綜上所述，HBO干預(yù)可有效延長力竭運(yùn)動(dòng)小鼠游泳時(shí)間，保護(hù)肝臟功能，其機(jī)制可能與提高肝臟組織抗氧化能力及ATP酶活性有關(guān)。本研究結(jié)論有望為提高競技運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)水平和防治運(yùn)動(dòng)損傷提供重要線索。