白花丹素對肝癌索拉菲尼耐藥細胞HepG2R增殖和凋亡的影響及其機制

朱德強，陳學軍

(錦州醫科大學基礎醫學院病理學與病理生理學教研室, 遼寧 錦州121000)

索拉菲尼作為肝癌臨床一線藥物，能夠抑制酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸等多種激酶[1]，有效抑制細胞的增殖。但隨著藥物的長期使用，臨床已經出現嚴重的耐藥現象[2]，降低了索拉菲尼的治療效果，急需尋找一種藥物聯合使用以增強其療效。白花丹素(plumbagin,PLB)作為一種中藥單體，研究[3-5]已證實PLB能夠明顯抑制食管癌、鼻咽癌、肺癌和前列腺癌等細胞的增殖。Pan等[6]研究顯示PLB可誘導前列腺癌細胞發生 G/M 期阻滯，引起其生長受限。Checker等[7]發現:PLB能夠上調淋巴瘤細胞中caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和磷酸化組蛋白的表達水平，破壞 DNA 雙鏈結構，提高細胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平，使得腫瘤細胞增殖受抑。研究[8]證明：PLB能升高癌癥細胞中ROS水平，但PLB在肝癌索拉菲尼耐藥細胞中的作用及機制尚未可知。本研究建立肝癌耐藥細胞株HepG2R，觀察PLB對耐藥細胞增殖和凋亡的影響，探討其對耐藥細胞的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 人肝癌HepG2細胞株購自中國科學院細胞庫。索拉菲尼(Sorafenib)和PLB購自美國Sigma公司，DMEM高糖培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，MTT 購自美國Promega 公司，結晶紫染色液、Hoechst33342染色、細胞凋亡檢測試劑盒和ROS檢測試劑盒購自上海碧云天公司，cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2抗體和兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司。CO2孵育箱購自美國Thermo公司，細胞流式細胞儀購自美國BD公司，激光共聚焦顯微鏡購自德國LEICA公司。

1.2 細胞培養和分組 人肝癌HepG2細胞培養在 DMEM 培養基中(含10%FBS、100 IU·mL-1青霉素和 100 mg·L-1鏈霉素、pH 7.2～7.4)，置于 37℃、5%CO2孵箱中培養，胰蛋白酶消化，每隔2 d以 1∶3 比例傳代，調整細胞狀態，待細胞處于對數生長期時進行實驗。索拉菲尼和PLB分別溶于二甲基亞砜( DMSO)中，存儲濃度為10 mmol·L-1，-20℃保存，實驗時現配現用，無血清培養基稀釋使用。采用逐步提高索拉菲尼濃度持續誘導HepG2細胞建立耐藥細胞株HepG2R,藥物濃度依次為2、5、8、11、14、17和19 μmol·L-1，反復誘導12周，細胞最終在19 μmol·L-1藥物濃度的培養基中穩定生長。將HepG2R細胞隨機分為對照組、索拉菲尼(5 μmol·L-1)組、PLB(2 μmol·L-1)組、索拉菲尼(5 μmol·L-1)聯合PLB(2 μmol·L-1)組(聯合組)。

1.3 MTT法檢測各組細胞活力 檢測各組藥物對細胞增殖的抑制作用。將處于對數增殖期的HepG2和HepG2R細胞鋪至96孔培養板，每孔約6 000個細胞，每孔加入100 μL完全培養基，每組設立5個復孔，以不含藥物處理的細胞作為陰性對照組。細胞培養48 h后，加入MTT( 5 g·L-1) 溶液，每孔20 μL MTT和80 μL無血清培養基，37℃、5%CO2環境中培養 4 h，輕輕抽掉培養液，每孔加入150 μL DMSO，室溫震蕩10 min，促使細胞中甲瓚充分溶解，采用酶標儀于波長490 nm處測定各孔內吸光度(A) 值，計算各組細胞活力。細胞活力=給藥組A值/空白組A值×100%；繪制細胞活力圖，計算HepG2和HepG2R細胞對索拉菲尼的半數抑制濃度(IC50)值；采用同樣操作，檢測不同濃度PLB作用48 h時和2 μmol·L-1PLB處理不同時間時各組細胞活力，繪制細胞活力直條圖。實驗均重復5次。

1.4 克隆形成實驗檢測各組細胞的克隆形成率 取對數生長期HepG2R細胞，鋪6孔板，每孔細胞約5×105個，根據分組情況進行藥物處理,藥物作用時間約為2周。待陰性對照組細胞長滿，取出細胞，PBS 輕輕漂洗2次；以5%甲醛固定30 min，PBS 輕輕漂洗3次；結晶紫染色 30 min，PBS漂洗3次；晾干照相；計算克隆形成率。克隆形成率=給藥組細胞數/對照組細胞數×100%。

1.5 Hoechst33342實驗檢測各組細胞凋亡形態表現 取對數生長HepG2R細胞，以胰蛋白酶消化，均勻鋪在12 孔培養板中，待細胞貼壁后，各組分別加入相應藥物作用48 h，棄去培養液，以PBS 漂洗3次，加入 Hoechst33342染色液(1 mg·L-1)，避光 37℃孵育20 min，以PBS 漂洗，熒光顯微鏡隨機選取多個視野進行觀察并照相。

1.6 流式細胞術(flow cytometry,FCM )檢測各組細胞凋亡率 取對數生長期HepG2R細胞，均勻鋪在6孔板中培養。按各藥物分組，藥物處理48 h后消化、離心，預冷PBS重懸，將細胞密度調至細胞 1×105mL-1，按 Annexin Ⅴ-FETC/PI 試劑盒說明書染色，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/(凋亡細胞數+正常細胞數)×100%。

1.7 Western blotting法檢測各組細胞中cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2相對表達水平 各組細胞經藥物作用 48 h后，PBS漂洗2次，消化、離心；采用 RIPA 緩沖液(含1% NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、1% SDS、0.1%PMSF)裂解；按照 BCA 定量說明書定量；SDS-PAGE 電泳；PVDF 膜轉膜，1% BSA封閉 1 h；一抗(1∶1 000 稀釋)4℃孵育過夜，TBST 漂洗3次，每次10 min；洗膜，二抗(1∶1 000)室溫孵育 1 h，TBST 洗滌3次；ECL 顯影，計算蛋白相對表達水平。各蛋白相對表達水平=給藥組灰度值/對照組灰度值，Bax/Bcl-2比值=給藥組Bax灰度值/給藥組Bcl-2灰度值。

1.8 各組細胞中ROS水平檢測 取對數生長期HepG2R細胞，胰蛋白酶消化，均勻鋪于6孔板中，待細胞貼壁后，各組分別加入相應藥物作用48 h，按照ROS檢測試劑盒操作并照相，計算ROS水平。ROS水平=實驗組綠色熒光細胞數/對照組綠色熒光細胞數×100%。

2 結 果

2.1 肝癌索拉菲尼耐藥細胞的建立和鑒定 小劑量持續給藥建立肝癌耐藥細胞株HepG2R，MTT法檢測索拉菲尼對正常肝癌細胞株HepG2和耐藥細胞株HepG2R增殖的抑制作用，以細胞活力為縱軸、以藥物梯度為橫軸繪制藥效曲線，見圖1。耐藥細胞株HepG2R對索拉菲尼的IC50值是HepG2的4.5倍(P=0.025)，耐藥細胞株建立成功，見圖2。

2.2 不同條件下各組細胞活力 PLB(0 μmol·L-1)處理細胞時，加入索拉菲尼(5 μmol·L-1)處理細胞對HepG2R細胞活力無影響(P=3.579)；PLB(1 μmol·L-1)處理細胞時，與未加索拉菲尼組比較，加入索拉菲尼(5 μmol·L-1)后細胞活力降低(P=0.032)；PLB (2 μmol·L-1)處理細胞時，與未加索拉菲尼組比較，加入索拉菲尼(5 μmol·L-1)后細胞活力降低(P=0.006)；隨著PLB濃度升高，HepG2R細胞對索拉菲尼敏感性升高，見圖3A。藥物作用24 h,與索拉菲尼組比較,聯合組細胞活力降低(P=0.029)；藥物作用48 h后，與索拉菲尼組比較,聯合組細胞活力明顯降低(P=0.000)；藥物作用48 h，與PLB組比較，聯合組細胞活力降低(P=0.012)，見圖3B。

圖1 HepG2和HepG2R細胞對索拉菲尼的藥效曲線

Fig.1 Pharmacodynamic curves of HepG2 and HepG2R cells for sorafenib

*P<0.05 compared with HepG2 cells.

Fig.2 IC50values of HepG2 and HepG2R cells for sorafenib

2.3 各組細胞克隆形成率 作用2周后，聯合組細胞克隆形成率(58.29%±1.16%)明顯低于索拉菲尼組(88.32%±2.06%)和PLB組(81.65%±1.32%)，差異有統計學意義(P=0.000，P=0.021)。見圖4和5。

*P<0.05 compared with PLB (without sorafenib) group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with sorafenib group；#P<0.05 compared with PLB group.

圖3 不同濃度PLB作用48 h時(A)和2 μmol·L-1PLB作用不同時間時(B)各組細胞活力

Fig.3 Cell vitalities in various groups after treated with different concentrations of PLB at 48 h after treatment (A) and treated with 2 μmol·L-1PLB for different treatment time

2.4 各組細胞細胞核凋亡形態表現 Hoechst 33342染色結果顯示：各組藥物作用48 h后，對照組細胞核淡染，索拉菲尼組和PLB組細胞核少部分濃染、明亮，聯合組細胞核大部分濃染，細胞核染色質固縮、明亮。見圖6(插頁五)。

2.5 各組細胞凋亡率 聯合組細胞凋亡率(35.92%±1.02%)明顯高于索拉菲尼組(7.16%±0.83%)和PLB組(9.27%±0.97%)(P=0.003，P=0.001)。見圖 7。

2.6 各組細胞中凋亡相關蛋白相對表達水平和Bax/Bcl-2比值 各組藥物作用48 h后，Western blottiing法檢測各組細胞中凋亡相關蛋白相對表達水平。與索拉菲爾組比較，聯合組細胞中cleaved Caspase-3相對表達水平和Bax/Bcl-2比值升高(P=0.000，P=0.001)；與PLB組比較，聯合組細胞中cleaved Caspase-3相對表達水平和Bax/Bcl-2比值升高(P=0.001，P=0.002)。見圖8和9。

2.7 各組細胞中ROS水平 對照組、PLB組和索拉菲尼組細胞中ROS水平較低，聯合組細胞中ROS水平明顯高于索拉菲尼組(P=0.002)和PLB組(P=0.005)。見圖10(插頁五)和圖11。

A:Control group; B:Sorafenib group; C:PLB group; D:Combination group.

圖4 各組細胞克隆形成情況

Fig.4 Clone formation of cells in various groups

*P<0.01 compared with sorafenib group；△P<0.05 compared with PLB group.

圖5 各組細胞克隆形成率

Fig.5 Clone formation rates of cells in various groups

3 討 論

肝細胞癌作為我國最常見的惡性腫瘤，其發病率和致死率居高不下，臨床多以手術治療為主，但術后極易復發[2, 9]，一些化療藥物的出現延緩了肝癌的進展，緩解了病情。索拉菲尼作為肝癌臨床治療的一線化療藥物，能有效地抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶和血小板衍生生長因子受體，還能抑制受體酪氨酸激酶血管表皮生長因子受體 2、網織紅細胞以及酪氨酸激酶受體等，從而阻止腫瘤細胞增殖和血管生成,但是肝癌索拉菲尼耐藥現象的出現嚴重限制其治療效果和應用。

A:Control group; B:Sorafenib group; C:PLB group; D:Combination group.

肝癌對索拉菲尼耐藥的機制十分復雜，隨著耐藥現象的出現，藥物療效的不斷下降，急需尋找一種化療增敏劑來抵抗藥物耐受。研究[10-12]顯示：天然藥物PLB具有良好的抗腫瘤作用，PLB來源于白花丹的根部提取物，對前列腺癌、乳腺癌和肺癌等具有良好的治療效果。研究[13]顯示：PLB能提高腫瘤細胞ROS水平，使腫瘤細胞增殖受到抑制。PLB還可降低急性髓性白血病HL-60細胞中Bcl-2表達水平，增加 Bax 表達水平，明顯升高caspase-3表達水平，促進細胞凋亡。

Lane 1:Control group; Lane 2:Sorafenib group; Lane 3:PLB group; Lane 4:Combination group.

圖8 各組細胞中凋亡相關蛋白表達電泳圖

Fig.8 Electrophoregram of expressions of apoptosis-related proteins in cells in various groups

*P<0.01 compared with sorafenib group；△P<0.01 compared with PLB group.

圖9 各組細胞中凋亡相關蛋白表達水平

Fig.9 Expression levels of apoptosis-related proteins in cells in various groups

圖11 各組細胞中ROS水平

氧化應激是體內微環境改變導致的一種氧化反應，引起大量氧化中間產物的形成，其中ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)和過氧化氫(H2O2)等，體內多種疾病的發生均與之有關[14-17]。文獻[18-19]報道：ROS水平升高能夠抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，與降低細胞線粒體膜電位有關，細胞因缺少ATP會引起自噬。自噬作為細胞的一種應激反應[20- 23]，細胞本身吞噬自身細胞質蛋白或細胞器使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，藉此實現本身的代謝需要和某些細胞器的更新。本實驗通過索拉菲尼小劑量持續給藥培養肝癌HepG2細胞，制備耐藥細胞模型HepG2R，采用MTT實驗確定藥物作用濃度和時間，根據篩選的藥物濃度和時間進行分組，比較各組細胞增殖和凋亡情況，發現PLB能明顯增強耐藥細胞對索拉菲尼的敏感性，并且提高耐藥細胞中ROS水平，與既往研究結論相符。

本研究為臨床肝癌索拉菲尼耐藥的治療提供了理論和實驗依據，但仍存在諸多不足，未來應該進行更多動物實驗和臨床研究探討耐藥細胞增敏的具體機制，為臨床治療肝癌耐藥提供一個新方案。