孕激素受體靶向聚乳酸-羥基乙酸-超順磁性氧化鐵分子探針的制備及其性能

章 娉,周 佳,唐 焱,劉紅雨

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科,湖南 衡陽421001)

近年來，隨著影像技術(shù)的高速發(fā)展，單一的影像技術(shù)已經(jīng)不能滿足臨床需要，多種影像技術(shù)結(jié)合可以提供更加完整而準(zhǔn)確的信息[1]。多功能顯像集合了超聲、磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)和光學(xué)等2種或多種成像技術(shù)優(yōu)勢(shì)，能在解剖、功能及分子水平對(duì)病變細(xì)胞發(fā)生發(fā)展與凋亡進(jìn)行多種模式顯示，為臨床提供更加完整而準(zhǔn)確的生物學(xué)信息。有學(xué)者[2]制備了一種集多種顯像(光學(xué)/MRI/X-ray)與治療(藥物載體)于一體的多功能分子探針，在體外實(shí)現(xiàn)了對(duì) HeLa 細(xì)胞的光學(xué)、MRI及X-ray 多模態(tài)成像，但國(guó)內(nèi)關(guān)于多功能顯像劑的研究[3]尚處于起步階段。孕酮受體在乳腺癌中的過度表達(dá)有利于針對(duì)這些受體進(jìn)行靶向成像。基于孕酮結(jié)構(gòu)的放射性探針可以用來靶向孕激素受體(progesterone receptor，PR)進(jìn)行乳腺癌成像。目前，將乳腺癌孕激素靶向受體與超聲、MRI及光學(xué)3種功能納米探針相結(jié)合的研究鮮見報(bào)道。本課題組制備了一種PR靶 向的包含超順磁性氧化鐵納米顆粒(super-paramagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)及具備液氣相轉(zhuǎn)變功能的液態(tài)全氟己烷(perfluorohexane,PFP)包裹在高分子材料聚乳酸/羥基乙酸[poly(laetide-co-glycolide acid)，PLGA]中，形成了具有超聲、MRI及光聲3種功能的聚乳酸-超順磁性氧化鐵及PFP(s-PFP/PLGA)納米顆粒，觀察其體外成像效果，為提高腫瘤早期診斷的靈敏度和準(zhǔn)確度提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

T-47d細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)Scien Cell公司，L929細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。三氯甲烷和甲苯(北京科璽有機(jī)溶劑有限公司)，MTT試劑盒(武漢博士德公司)，PLGA(深圳市博立生物材料有限公司)，油酸修飾超順磁性氧化鐵納米顆粒(北京安唯安實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，PFP(美國(guó)Alfa公司)，聚乙烯醇(PVA，美國(guó)Sigma公司),DiI 細(xì)胞膜紅色熒光探針(上海碧云天生物有限公司)。CO2培養(yǎng)箱和離心機(jī)(沈陽精工華之翼機(jī)械有限公司)，倒置顯微鏡和透射顯微鏡(美國(guó)Beckman公司)，掃描電鏡(上海蔡康光學(xué)儀器廠)，流式細(xì)胞儀(德國(guó)Partec公司)，3.0 TMR儀(美國(guó)GE公司)，Malvern激光測(cè)徑儀和DCZ 型超聲輻照微泡(微球)腫瘤治療系統(tǒng)(日本Olympus公司)，XL2020 聲振儀、高速分散均質(zhì)機(jī)和液相閃爍計(jì)數(shù)儀(美國(guó)GE公司)，機(jī)械振蕩儀(重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司)。

1.2 s-PFP/PLGA納米顆粒的構(gòu)建

將PLGA-COOH 和 SPIO按比例溶于三氯甲烷，加入少量PFP，冰浴條件下振蕩，加入適量 5% PVA 液，混勻，加入 2%異丙醇，冰浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 1～2 h；雙蒸水洗滌、離心、收集，即得到多功能顯像劑(s-PFP/PLGA組)。同法制備不含SPIO微球的PFP/PLGA作為對(duì)照。PBS設(shè)定為空白對(duì)照。

1.3 s-PFP/PLGA納米顆粒的一般特征檢測(cè)

采用光學(xué)和透射電鏡檢測(cè)s-PFP/PLGA納米顆粒形態(tài)表現(xiàn)，Malvern激光測(cè)徑儀測(cè)定s-PFP/PLGA納米顆粒的直徑和平均電位。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將s-PFP/PLGA配制為如下濃度：400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、6.3、3.2和1.6 mg·L-1，隨后加入至L-929細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后，加入MTT混合4 h，加入DMSO，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度(A)值。陰性對(duì)照組單純加入培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加入s-PFP/PLGA。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR )，RGR=實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組A值×100%。毒性分為6級(jí)：RGR=100%為0級(jí)、75%≤RGR<100%為1級(jí)、50%≤RGR<75%為2級(jí)、25%≤RGR<50%為3級(jí)、1%≤RGR<25%為4級(jí)、0%≤RGR<1%為5級(jí)。

1.5 s-PFP/PLGA納米顆粒多模態(tài)顯像

1.5.1 s-PFP/PLGA納米顆粒的體外MRI 將s-PFP/PLGA納米顆粒與凝膠按1∶5比例稀釋，振蕩搖勻。采用MRI掃描儀掃描，記錄樣品的T2*W1值。

1.5.2 s-PFP/PLGA納米顆粒的體外光聲成像 將s-PFP/PLGA納米顆粒以 PBS 液稀釋滴于蓋玻片上，置于光聲成像儀中。以380 nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)，記錄光聲信號(hào)，采集光聲成像圖，與不含光吸收子的普通高分子顯像劑的PBS液作為對(duì)照。激光發(fā)射過程中，不斷提高激發(fā)激光能量，直至溫敏材料 PFP 發(fā)生液-氣相轉(zhuǎn)變，觀察該過程中顯像劑光聲信號(hào)、光聲成像及超聲成像的變化。

1.5.3 s-PFP/PLGA納米顆粒的體外超聲成像 分別將濃度為3.125、6.250、12.500、15.000和25.000 g·L-1s-PFP/PLGA納米顆粒置入用凝膠(1%)制成的孔洞模型中，以 PBS 液作為對(duì)照。以380 nm波長(zhǎng)的激光輻照稀釋液，采用高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)對(duì)各孔進(jìn)行掃描，記錄圖像及回聲強(qiáng)度值。

1.6 DiI標(biāo)記的攜PR的多功能分子探針的制備

采用碳二亞胺法制備DiI 標(biāo)記的攜帶PR的多功能分子探針。將s-PFP/PLGA納米顆粒溶于10 mL 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液中，加入90 mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)， 4℃下混合 2 h，洗滌離心，將顆粒溶于 10 mL MES 溶液中，隨后加入一定量DiI 熒光標(biāo)記的PR，4℃下混合1 h 后，洗滌離心即為PR-s-PFP/PLGA。

1.7 細(xì)胞尋靶實(shí)驗(yàn)觀察試劑與細(xì)胞的結(jié)合情況

將DiO綠色熒光標(biāo)記的T-47d分為靶向顯像劑組、非靶向組和空白對(duì)照組。37℃條件下反應(yīng)2 h，洗滌 3 次，激光共聚焦顯微鏡觀察試劑與細(xì)胞的結(jié)合情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 s-PFP/PLGA納米顆粒的制備及其物理性質(zhì) 成功制備s-PFP/PLGA納米顆粒，其內(nèi)同時(shí)包裹Fe3O4和液態(tài)PFP。掃描電鏡觀察可見顆粒形態(tài)規(guī)則呈球形，大小均勻一致，粒徑約為(738.5±181.2)nm，平均電位為(-15.8±5.7)mV，分散度好，球面欠光滑。原子吸收光譜法測(cè)得微球中鐵濃度為42.41 mg·L-1。透射電鏡下可見顆粒呈球形，外殼中Fe3O4顆粒分布于其中。見圖1。

A：Scanning electron microscope；B：Transmission electron microscope；C：Transmission electron microscope of single microsphere.

圖1 掃描電鏡和透射電鏡下s-PFP/PLGA納米顆粒的形態(tài)表現(xiàn)

Fig.1 Morphology of s-PFP/PLGA nanoparticles under scanning electron microscope and transmission electron microscope

2.2 各組T-47d細(xì)胞的RGR

不同濃度(400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、6.3、3.2和1.6 mg·L-1)納米顆粒與乳腺癌細(xì)胞作用后，RGR分別為(99.82±12.13)%、(99.49±11.24)%、(99.30±14.07)%、(95.88±12.31)%、(95.59±13.06)%、(92.59±16.12)%、(90.10±13.56)%和(90.09±13.23)%，提示納米顆粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞毒性小。

2.3 不同濃度s-PFP/PLGA納米顆粒的體外MRI

隨著s-PFP/PLGA納米顆粒中鐵濃度的增加，T1 加權(quán)圖像上的信號(hào)得到增強(qiáng)，成像圖像變得更為亮白，說明樣品具有很好的MRI造影增強(qiáng)的效果。見圖2。

2.4 不同濃度s-PFP/PLGA納米顆粒的體外超聲成像和回聲強(qiáng)度

隨著s-PFP/PLGA納米顆粒濃度的增加，其回聲強(qiáng)度逐漸升高，造影效果逐漸增強(qiáng)。見圖3(插頁六)和圖4。

2.5 體外光聲成像

含s-PFP/PLGA顆粒的PBS 液檢測(cè)到明顯的光聲信號(hào)，但不含光吸收子的普通高分子顯像劑和PBS液未檢測(cè)到光聲信號(hào)。見圖5(插頁六)。

Lane 1:1.00 g·L-1s-PFP/PLGA;Lane 2:0.50 g·L-1s-PFP/PLGA;Lane 3:0.10 g·L-1s-PFP/PLGA;Lane 4:0.05 g·L-1s-PFP/PLGA;Lane 5:0.01 g·L-1s-PFP/PLGA.

圖2 不同濃度s-PFP/PLGA納米顆粒的體外MRI

Fig.2 MRIinvitroof s-PFP/PLGA nanoparticles with different concentrations

A:0 g·L-1s-PFP/PLGA;B:3.125 g·L-1s-PFP/PLGA;C:6.250 g·L-1s-PFP/PLGA;D:12.500 g·L-1s-PFP/PLGA;E:15.000 g·L-1s-PFP/PLGA;F:25.000 g·L-1s-PFP/PLGA.

圖4 不同濃度s-PFP/PLGA納米顆粒的回聲強(qiáng)度

Fig.4 Echo intensities of s-PFP/PLGA nanoparticles with different concentrations

2.6 試劑與各組細(xì)胞的結(jié)合情況

空白對(duì)照組細(xì)胞膜基本無紅色熒光，非靶向組可見少量紅色熒光，而靶向顯像劑組可見大量紅色熒光，說明多功能分子探針可以結(jié)合PR受體陽性的乳腺癌。見圖6(插頁六)。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，給婦女的身心造成嚴(yán)重的傷害。研究[4-5]顯示：部分乳腺癌患者低表達(dá)PR，該類腫瘤高度惡性，發(fā)展迅速，復(fù)發(fā)率高，較早轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良。

隨著生物工程的發(fā)展，納米技術(shù)靶向藥物技術(shù)逐漸成熟[6]。Xu等[7]將納米顆粒與PFOB 融合，從而使超聲和CT 成像增強(qiáng)，并對(duì)裸鼠移植瘤具有光熱治療作用。但如何制備一種多功能顯像劑材料使之具備多種臨床功能，并將之與靶向治療的功能相結(jié)合是尚需要攻克的科研難點(diǎn)。

s-PFP/PLGA納米顆粒是一種新型材料，直徑小、可修飾性強(qiáng)，超順磁性強(qiáng)、靈敏度高、靶向性好，毒性低、半衰期較長(zhǎng)[9-10]。PLGA是一種可降解的高分子物質(zhì)，幾乎無毒，生物相容性好、成囊和成膜性能強(qiáng)大，并且可以溶解于多種有機(jī)溶劑，已經(jīng)用于造影劑的制備，造影劑的外殼抗壓性較強(qiáng)[11-12]。另一種核心材料PFP表面張力低、絕緣性好、各項(xiàng)性質(zhì)比較安全、無毒性，在各種刺激下可發(fā)生液氣相轉(zhuǎn)變[13]。

PFP與水不相容，兩者聲阻抗不匹配， 因此在常溫下可以檢測(cè)到s-PFP/PLGA納米顆粒強(qiáng)回聲，具有增強(qiáng)超聲造影的作用[14-15]。本研究制備的s-PFP/PLGA納米顆粒在HIFU輻照后顯影增強(qiáng)，這可能是因?yàn)镻FP介質(zhì)受熱局部溫度升高，當(dāng)溫度達(dá)到液態(tài)氟碳相變閾值時(shí)發(fā)生液-氣相轉(zhuǎn)變，微粒變?yōu)槲⑴荩鰪?qiáng)散射信號(hào)而增強(qiáng)超聲顯影[16]。SPIO 在外加磁場(chǎng)作用下能明顯縮短橫向馳豫時(shí)間(T2)，是一種較理想的MRI陰性對(duì)比劑。本研究結(jié)果表明：隨著s-PFP/PLGA納米顆粒中鐵濃度的增加，T1 加權(quán)圖像上的信號(hào)得到增強(qiáng)，成像圖像變得更為亮白，這與其他研究者[17]的研究結(jié)果基本一致，與其他材料比較，本實(shí)驗(yàn)采用PLGA作為殼膜材料使制備的造影劑更為穩(wěn)定。

SPIO是一種特殊材料，可以吸附激光，SPIO微粒在激光的照射下導(dǎo)致微粒溫度升高，微粒隨之膨脹，引起光聲信號(hào)，信號(hào)輻射后經(jīng)一系列處理，可用于光聲學(xué)成像[18]。本研究結(jié)果表明：s-PFP/PLGA納米顆粒在激光照射后可產(chǎn)生光聲信號(hào)。 目前對(duì)于乳腺癌的無創(chuàng)治療成為研究的熱點(diǎn)。結(jié)合了多功能顆粒和PR靶向的探針，集超聲-核磁-光熱治療于一體，在消滅癌細(xì)胞的同時(shí)還可以動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)患者的臨床療效[19]。多功能探針與乳腺癌細(xì)胞的靶向結(jié)合體外試驗(yàn)表明制備的探針具有靶向能力，這與其他研究[20]的結(jié)果一致。但本研究結(jié)論尚需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。

綜上所述，本研究制備的集超聲-核磁-光熱治療于一體的PR靶向探針生物性能良好，靶向性強(qiáng)。