甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因突變與超聲及病理特征相關性研究

李征毅 趙永勝 李鋒 劉偉宗 關弘

甲狀腺癌是常見的內分泌腫瘤，其組織學類型以甲狀腺乳頭狀癌（PTC）最多，大約占所有甲狀腺癌的70%～90%，其發生、發展與基因遺傳、社會因素等相關，也涉及多種基因的改變[1?3]。高分辨力超聲的發展使得PTC的檢出率和診斷特異性取得巨大進展，但仍存在不足，超聲引導下細針抽吸細胞學檢查是目前術前診斷甲狀腺癌的標準方法，特異性高，但其最大的缺點在于仍存在約15%～25%細胞學不確定性（根據Bethesda分類法）[4]。

各種基因檢測可提高超聲引導細針穿刺活組織檢查（活檢）的診斷性能，尤其是BRAF基因突變，因為其在PTC中的高突變率和高特異性而受到更多的關注[5?6]。許多研究也表明BRAF基因突變與可疑超聲表現存在相關性。但是，目前較少文獻對PTC的超聲特征與BRAF基因突變之間的關系進行研究，由于腫瘤的徑線不同，導致其表現也多種多樣[7]。因此，本研究對PTC樣本的BRAF基因變異、超聲特征以及病理學表現進行分析研究。

對象與方法

一、研究對象

收集2016年1月至2017年10月在深圳市第二人民醫院診斷為PTC或者微小乳頭狀癌的病例247例，病灶最大徑均至少0.5 cm。所有病例均保有完整病理信息、超聲信息和臨床資料，包括一般情況、病理診斷以及必要的免疫組織化學（組化）信息。所有病例均知情同意，可疑病灶的FNA及BRAF基因檢測均是在手術之前進行。247例患者中，病理細胞學結果顯示190例為PTC，50例為可疑乳頭狀癌，6例為細胞不典型表現，1例為濾泡性結節。其中5例為不典型細胞學表現患者因為具典型PTC超聲征象接受手術，另外1例行超聲引導下粗針組織學活檢后證實為PTC。1例濾泡性結節患者，由于超聲引導下引流區域淋巴結粗針活檢顯示為來源于甲狀腺的轉移癌而接受手術。

所有患者均接受甲狀腺全切術或次全切術，預防性或者治療性的中央區淋巴結清掃。對經針吸細胞學活檢證實或術中發現具有可疑轉移的進行頸側區淋巴結清掃。

二、超聲檢查、病理檢查及基因突變檢測

超聲檢查：使用百勝MYLAB?TWICE進行甲狀腺檢查，線陣探頭，頻率3～13 MHz。超聲掃查為具10年甲狀腺專科方面超聲經驗的醫師進行。所有超聲檢查均在BRAF突變檢測前進行。分析以下超聲征象：囊實性、回聲性質（高回聲、等回聲、低回聲以及極低回聲）、鈣化情況（微鈣化，粗大鈣化和無鈣化）及形狀（縱橫比）。超聲表現中微鈣化、形態不規則或分葉，極低回聲，長軸垂直于皮膚等認為是惡性征象。

病理檢查：全部病例由1～2名高年資病理醫師重新閱片復診。病理學記錄包含患者的性別、年齡等。主要關注的病理資料：腫瘤的測值，BRAF基因突變檢測結果，結節數目，是否包膜外侵襲，中央區及頸側區淋巴結轉移情況，根據第7版的癌癥分期指南進行的TNM分期。根據文獻[8]，將直徑≤1 cm的PTC定義為微小乳頭狀癌。

所有病例根據樣本自身腫瘤細胞分布，挑選腫瘤細胞含量最高的玻片直接封存于1.5 ml EP管中。后經二甲苯脫蠟后用天根石蠟包埋組織DNA提取試劑盒 （DP331）提取，具體流程參考試劑盒說明書。所有提取好的樣本DNA均用Thermo NanoDrop 2000進行測定濃度，確定樣品無蛋白污染，OD260/OD280=1.8～2.0；提取完的DNA若未立即進行檢測，則于-20℃保存。

基因突變檢測：所有樣本DNA均稀釋至50～100 ng/μl后取2μl用北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司提供的B?raf基因突變檢測試劑盒（熒光PCR?毛細管電泳測序法）（產品號：SMD?01?061）進行后續Braf基因突變檢測。操作流程按照試劑盒說明書進行，最終獲得的測序產物取12μl在ABI3500Dx測序儀上機檢測，檢測操作按照測序儀說明書進行。測序數據以Snapgene Viewer 4.0.5分析，與正常的人BRAF基因序列（NG_007873.3）中的外顯子15進行序列比對，以確定樣本是否存在BRAF V600位置上的突變。

三、統計學處理

采用SPSS 21.0進行分析。計算BRAF基因突變率。BRAF基因突變陽性和陰性患者的超聲征象和病理結果進行對比分析。無序分類資料組間比較采用χ2檢驗或者Fisher確切概率法，等級資料組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、PTC與微小乳頭狀癌BRAF突變率比較

247例患者PTC中，103例（41.7%）是甲狀腺微小乳頭狀癌，144例（58.3%）為PTC，其中甲狀腺微小癌組BRAF基因突變發生率為43.7%（45/103），低于PTC組的70.8%（102/144），2組比較差異有統計學意義（χ2=18.362，P＜0.001）。

二、PTC患者BRAF突變與超聲圖像特征分析

BRAF突變陽性病例的PTC病灶在形態、邊界、邊緣、鈣化、內部回聲等方面，與BRAF突變陰性病例比較差異均無統計學意義（P均＞0.05），見圖1～3、表1。

圖1 一例PTC患者甲狀腺右側葉超聲圖

二、PTC患者BRAF突變與病理學特征分析

與BRAF基因突變陰性PTC患者對比，陽性患者中男性比例似乎更高，但差異無統計學意義（χ2=3.366，P=0.067）。BRAF基因突變陽性的患者更容易出現腫瘤徑線≥10 mm、腺體外侵犯、淋巴結轉移以及TNM較高的分期（P均＜0.05）。而多灶性甲狀腺癌則暫時未見與BRAF基因突變有必然聯系（χ2=0.195，P=0.659），見表2。

圖2 PTC患者BEAF基因測序圖

圖3 PTC患者BEAF基因測序圖

討 論

BRAF基因突變的作用包括下調抑癌基因和增加促腫瘤生長的因子，其結果是促進腫瘤生長，腫瘤血管的生成，組織侵襲和遠處轉移。除此之外，許多文獻表明BRAF基因突變與不良的預后之間有直接關系，如腺體外侵襲、淋巴結或遠處轉移，腫瘤分期較晚和腫瘤復發，但這些觀點尚存爭議[9?10]。BRAF基因是一種癌基因，編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉導因子，參與調控細胞內多種生物學事件。BRAF基因位于7p34，長約190 kb，轉錄mRNA長2.5 kb，編碼783氨基酸的蛋白，相對分子質量為

94 000～95 000。BRAFV600E基因突變經常出現在人類惡性腫瘤中，BRAF突變主要發生在外顯子15上的激活區的第1 799氨基酸上（T突變為A），導致編碼的氨基酸由谷氨酸變成纈氨酸（V600E），使BRAF激酶活性提高，進而通過磷酸化作用使BRAF蛋白激活。BRAFV600E基因突變是甲狀腺癌中最常見的遺傳學事件，且在PTC中的發生率最高，達29%～88%，我們推測這個突變率范圍分布如此之廣的原因可能是PTC的亞型多樣、受試者的背景不一以及研究方法不同。本研究資料所得的突變率為57.9%[11]。

表1 PTC患者BRAF突變與PTC超聲特征分析

表2 PTC患者BRAF基因突變與臨床病理特征相關性分析

PTC中超聲征象與BRAF基因突變的關系，多數學者的研究傾向于認為BRAF基因突變陽性與陰性之間的PTC超聲征象的差異無統計學意義[12]。韓國學者針對微小乳頭狀癌的研究也顯示兩者之間差異無統計學意義[6]。與之不同的是，Kwak等（2009年）針對115例PTC患者BRAF基因突變陽性的研究表明，腫痛徑線大于10 mm的乳頭狀癌與可疑惡性超聲征象以及惡性超聲征象的數目呈正相關，但在此研究中，作者也表明，由于甲狀腺微小乳頭狀癌的超聲征象不典型，與良性病灶征象存在重疊而且很難準確鑒別的。而本研究結果表明無論腫痛徑線大于等于10 mm或小于10 mm的PTC患者，其超聲征象與BRAF基因突變有關系。用于對甲狀腺結節判讀分類的超聲征象也與BRAF基因突變陽性無明顯關系，盡管腫痛徑線大于10 mm的PTC患者更傾向于與BRAF基因突變陽性相關。

我們假設這個偏差是由于我們的研究人群與前述研究的樣本存在差異引起的，2組患者使用的大多數可疑惡性的超聲征象是一樣的，因此可能導致BRAF突變陽性和陰性的患者會傾向于在超聲特征上無明顯差別。本研究表明，針對進行細針抽吸活檢的惡性甲狀腺結節的BRAF基因檢測陽性與陰性之間的超聲征象并無差異。

BRAF陽性的PTC的結節徑線，無論是超聲測值的或者是病理測量的均較BRAF陰性組的要大一些。之前的研究報道BRAF突變與腫瘤大小之間存在關系，這似乎表明BRAF突變陽性可導致腫瘤的增長與侵襲性。然而，本研究結果與此不同，結果顯示BRAF突變與腫瘤大小之間的關系存在爭議。我們的結果也顯示BRAF突變在男性中更易出現，這點與之前的研究一致。

既往的研究表明PTC病理特點中有一項或多項高危指標與BRAF基因突變相關[13]。本研究的結果與最近的薈萃分析和大樣本調查結果一樣，也表明甲狀腺腺體外浸潤、淋巴結轉移及TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的比例更高等均與BRAF基因突變相關。此外，最近一項隨訪15年的研究表明BRAF基因突變與腫瘤更高的分期、血管侵犯以及病死率相關。但也有學者研究結果與之相反，認為它們之間并無相關性。究其原因，得出相悖的結論可能是由于研究樣本中PTC的亞型不一，而本研究中所選擇病例均為同一亞型的PTC；此外，地理、人文倫理因素、就診時疾病所處發展的時期不同均存在影響，另外BRAF分析的方法不同以及預防性中央區淋巴結清掃的指征把握不一均有影響[14]。

結合本組數據的結果與其它學者的前期工作，可將BRAF基因突變應用到臨床實踐中，初步認為可包括以下2個方面：①利用BRAF基因突變檢測提高術前PTC的臨床診斷，結合超聲介入與基因檢測，對未能確診的甲狀腺結節FNA樣本進行BRAF基因突變檢測，期望可以幫助提高PTC的確診率；②利用BRAF基因突變檢測協助術前評估和處理方案制訂，研究結果表明BRAF基因突變與PTC腺體外侵犯、淋巴結轉移及腫瘤復發密切相關，因此BRAF基因突變可作為預測腫瘤預后的早期、有效方法之一。術前檢測FNA標本的BRAF基因突變可能是輔助術前風險分級、決定手術方式和制訂術后治療和隨訪策略的重要手段。這有助于平衡PTC治療的益處和風險，尤其是無影像學證據幫助時，決策淋巴結是否清掃以及清掃區域，達到既減少PTC的復發又減少治療副作用的最佳平衡。

綜上所述，PTC患者BRAF基因突變率較高，突變陽性與否與甲狀腺癌的超聲圖像特征無相關性；而與多項病理特點相關，利用研究的結果，可幫助提高PTC的確診率以及協助術前評估和處理方案制訂。本研究尚存部分不足之處：受研究時間的限制，未對術后患者長時間隨訪；未評估不同超聲醫師之間對病灶描述可能存在的差異；未利用新興的彈性成像技術增加對病灶的評估。