SIRT1及相關因子在抗結核藥物致人肝細胞損傷中的作用

張一楊，李瑩淑，李金鳳，李 標，崇英之，鄭國穎，孫淑豐，馮福民

(華北理工大學公共衛生學院/河北省煤礦衛生與安全重點實驗室，河北唐山 063000)

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種慢性傳染性疾病，并在全世界廣泛流行，亞洲是結核病發病率和病死率較高的地區。目前世界衛生組織(WTO)推薦的臨床上抗結核病的一線治療方案仍包括異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)的聯用，但異煙肼和利福平聯合應用時產生的肝毒性所引起的抗結核藥物性肝損傷(anti-tuberclosis drug-induced liver injury，ADLI)是其最主要且最嚴重的不良反應之一[1]。目前認為抗結核藥物代謝引起的炎癥反應在肝損傷的發生過程中起重要作用，并可能成為ADLI防治的重要靶點[2]。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)作為催化核心組蛋白和非組蛋白發生去乙酰化作用的重要酶類物質，在調控細胞生長、參與氧化應激反應和炎癥基因表達等方面發揮著重要功能[3-4]。沉默信息調節因子1(SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，與細胞衰老、抗氧化應激、抑制炎癥和能量代謝調節等細胞多種功能活動有關[5-8]。研究發現，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)在肝臟炎癥等損傷中起著重要作用，而激活SIRT1-NF-κB信號通路可以改善和治療酒精性肝損傷[9]。因此，已知NF-κB是SIRT1的靶分子，故推測在抗結核藥物致肝損傷過程中由NF-κB介導的促炎癥反應增強也可能與SIRT1的表達變化有關。本研究通過抗結核藥物異煙肼和利福平聯合刺激人正常肝細胞，觀察在其致肝細胞損傷過程中SIRT1及相關因子的表達變化，并通過加入SIRT1的激動劑SRT1720影響SIRT1表達，觀察其對下游炎癥因子的影響，從而探討SIRT1及相關因子在抗結核藥物致人肝細胞損傷中的作用，為ADLI的預防和結核病患者的高效保肝治療研究提供依據。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 人正常肝細胞株HL-7702引自上海中科院細胞所；異煙肼(批號：YSMXE-OM)、二甲基亞砜[(dimethyl sulfoxide，DMSO)批號：W3OKK-MI]購自日本TCI公司；青霉素與鏈霉素(批號：1634678)購自德國BI公司；0.25%胰蛋白酶(批號：25200-072)購自美國GIBCO公司；SIRT1激動劑SRT1720(批號：S112906)購自美國Selleck公司；90% Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640(批號：24916002)購自美國CORNING公司；10%胎牛血清(批號：JC50166)購自美國CLARK公司；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(批號：AK4601)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒(批號：AK4602)購自大連寶生物工程有限公司；TRI pure Reagent 總RNA抽提試劑盒(批號：0020161010)購自北京百泰克生物技術有限公司；丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(批號：20170301)購自南京建成生物工程研究所；SIRT1、NF-κB p65、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α) 蛋白檢測試劑盒(批號：201612)購自北京冬歌偉業生物技術有限公司。Heraeus高速冷凍離心機購自德國Thermo Scientific公司；CA94089型連續光譜酶標儀購自美國Molecular Devices公司；C1000PCR擴增儀購自美國BIO-RAD公司；實時熒光定量PCR(RT-PCR)儀器購自美國Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 用含90%RPMI 1640，10%胎牛血清，1%雙抗的培養液作為HL-7702細胞的培養基，將細胞放置于5%CO2，37 ℃的細胞培養箱中進行培養。取對數生長期的細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL，接種到6孔板上，每孔為2 mL。接種預培養24 h后更換培養基并給予相應處理，再次培養48 h后分別收集細胞及上清液。

1.2.2細胞分組及干預 將實驗按處理不同分為A、B、C、D 4組，A組：采用1640培養基作為空白對照；B組：采用含120 μg/mL異煙肼和240 μg/mL利福平的1640培養基；C組：采用含120 μg/mL異煙肼，240 μg/mL利福平和1 μmol/L SIRT1激動劑SRT1720的1640培養基；D組：采用含1 μmol/L SIRT1激動劑SRT1720的1640培養基作為SIRT1激動劑對照。

1.2.3細胞上清液中ALT、AST水平檢測 收集細胞培養的上清液，嚴格按照商品化的ALT、AST檢測試劑盒說明書進行操作，測定各指標水平。

1.2.4肝細胞中SIRT1、NF-κB p65 mRNA表達水平的檢測 采用RT-PCR方法測定肝細胞中SIRT1、NF-κB p65 mRNA表達水平。收集細胞用Trizol提取RNA，測定并計算RNA的純度和濃度；取RNA在逆轉錄酶的作用下合成cDNA。用SYBR Green嵌合熒光法進行實時PCR擴增。反轉錄和RT-PCR嚴格按照試劑盒說明書進行操作。反轉錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 min。mRNA表達水平的檢測以GAPDH為內參，反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環。熒光引物均由上海生工負責設計與合成，引物序列如下，GAPDH上游引物：5′-GAA GGT CGG AGT CAA CGG ATT-3′，下游引物：5′-CCT GGA AGA TGG TGA TGG GAT-3′；SIRT1上游引物：5′-CAT AGA CAC GCT GGA ACA GG-3′，下游引物：5′-TTG AGG GAA GAC CCA ATA ACA-3′；NF-κB p65上游引物：5′-GCG AGA GGA GCA CAG ATA CC-3′，下游引物：5′-GCA CAG CAT TCA GGT CGT AG-3′。采用2-ΔΔct計算mRNA表達水平。

1.2.5肝細胞中SIRT1、NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白水平的檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測肝細胞中SIRT1、NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1各組細胞上清液中ALT、AST水平比較 抗結核藥物刺激引起HL-7702細胞上清液ALT、AST水平增加，與A組比較，B、C組細胞上清液ALT、AST水平均明顯升高(P<0.01)；D組與A組比較差異無統計學意義(P>0.05)。與B組比較，C組的ALT、AST水平明顯降低(P<0.01)，見表1。

2.2各組細胞上清液中SIRT1、NF-κB p65 mRNA和蛋白等水平比較 與A組比較，B組HL-7702細胞的SIRT1 mRNA和蛋白表達降低，NF-κB p65的mRNA和蛋白及IL-6、TNF-α蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。D組與A組各炎癥因子表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與B組比較，C組細胞的NF-κB p65 mRNA和蛋白及IL-6、TNF-α蛋白表達下降，SIRT1 mRNA和蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

表1 各組細胞上清液中ALT、AST水平比較

a：P<0.01,與A組比較；b：P<0.01,與B組比較

a：P<0.01,與A組比較；b：P<0.05,c：P<0.01,與B組比較

3 討 論

目前對抗結核藥物性肝損傷的研究較為深入，但由于其機制十分復雜，迄今為止尚不明確。SIRT1是廣泛存在在人類組織細胞中的一種蛋白，屬于第Ⅲ類HDAC，目前在肝臟疾病中已備受關注。有研究顯示，SIRT1激活劑白藜蘆醇可能通過調控SIRT1/p53信號通路和抑制對乙酰氨基酚的活化進而保護對乙酰氨基酚誘導的肝損傷[10]。此外，SIRT1缺乏還可以抑制lipin-1信號通路進而加重酒精性肝損傷，提示SIRT1是調控酒精性肝損傷的重要因子[11]。本研究結果顯示SIRT1在抗結核藥物致人正常肝細胞損傷的過程中呈低表達狀態，提示其可能參與到抗結核藥物致人正常肝細胞損傷的過程中。

越來越多的研究發現藥物代謝引起的炎癥反應在其發生、發展過程中起著重要的作用。NF-κB是一組廣泛存在于真核細胞細胞質內的復合蛋白，是一種核轉錄因子，當其被激活后可移位至細胞核內并與相應的雙鏈DNA結合，從而啟動下游多種基因的表達，在炎癥發生和發展中起著極其重要的作用[12]。有研究發現，使用抗炎藥物Corilagin治療膽汁淤積性肝損傷的動物，隨著治療時間的延長，NF-κB水平明顯下降，這證明了NF-κB與肝臟疾病密切相關[13]。課題組前期研究發現，異煙肼致小鼠肝損傷發生過程中，NF-κB通路被激活，促炎性因子TNF-α過量產生，而利福平使NF-κB表達先升高后降低[14]。本研究結果顯示，異煙肼、利福平聯用引起的肝細胞損傷中NF-κB p65表達升高，炎癥因子IL-6、TNF-α也隨之表達上升，這可能是綜合了異煙肼的促進作用和利福平的抑制作用，進一步提示藥物代謝引起的炎癥反應在ADLI發生過程中的重要作用。

早有研究指出，在炎癥反應中，NF-κB的p65亞單位是SIRT1的直接靶點，SIRT1通過去乙酰化其第310位賴氨酸殘基，進而降低NF-κB p65的乙酰化水平，從而抑制其對于下游炎癥因子的轉錄[15]。為深入探討差異SIRT1表達參與的生理功能，本研究通過加入特異性SIRT1激動劑來改變SIRT1表達情況，進而觀察細胞炎癥損傷的改變。結果發現，SIRT1的激活減輕了抗結核藥物引起的炎癥反應，而這很可能是由SIRT1對NF-κB p65的去乙酰化作用來實現的。

盡管本研究推測出SIRT1低表達與抗結核藥物致人正常肝細胞損傷的關系，但尚未明確其具體機制。有研究學者發現，SIRT1能夠對Per2基因啟動子區組蛋白H3K9、H4K16進行去乙酰化從而抑制其轉錄，進而調節生物鐘和機體老齡化的平衡狀態[16]。因此，在抗結核藥物致人肝細胞損傷過程中，SIRT1調控炎癥反應的機制還可能是通過對NF-κB p65靶基因啟動子區組蛋白發揮去乙酰化來完成的，這有待于進一步研究。