人參皂苷Rh1、CK改善酒精性肝損傷及線粒體結(jié)構(gòu)的研究

李明珂，陳徐佳，武紹梅，文孟良，董向前，艾 黎，邊 莉，朱云珍，羅 娟，馬嵐青△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科/云南省消化疾病研究所，昆明 650032；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650091；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，昆明 650032)

隨著乙醇在全世界范圍內(nèi)的廣泛消費，其已逐漸成為引起肝臟疾病的主要原因[1]。近年來，人參皂苷抗慢性肝病的研究正成為熱點。人參皂苷含20多種單體成分，如人參皂苷Rg1、Rg3、Rb1、Rh1、Rh2等。研究表明，人參皂苷能明顯降低酒精性損傷小鼠的肝臟系數(shù)、血清三酰甘油(TG)水平及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活力，可在一定程度上降低肝臟組織中丙二醛水平，減少組織病理損傷[2]。作為人參皂苷單體代謝產(chǎn)物，人參皂苷Rh1及CK在酒精性肝損傷過程中有著怎樣的作用，本文通過誘導(dǎo)大鼠酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)模型，對經(jīng)不同處理后各組大鼠的肝酶水平、肝組織病理及線粒體體視學(xué)變化進(jìn)行對比、分析，希望能為今后提取人參皂苷有效成分治療ALD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑 人參皂苷Rh1、人參皂苷CK、人參皂苷Rh1∶CK=1∶1混合物、三七總皂苷(PNS)由云南與諾生物工程有限責(zé)任公司參照文獻(xiàn)[3]報道的方法從人參或三七藥材中提取、酶轉(zhuǎn)化、分離和純化；含量：高效液相色譜(HPLC)≥99%；紅星二鍋頭(北京紅星股份有限責(zé)任公司生產(chǎn))購于沃爾瑪超市；金龍魚玉米油(西班牙生產(chǎn))購于沃爾瑪超市；吡唑、10%甲醛、2%戊二醛、0.9%生理鹽水購于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.1.2動物 健康SD大鼠100只，體質(zhì)量(180±20)g，雄鼠，購自昆明醫(yī)科大學(xué)動物科，動物合格證號：SCXK(滇)2015-0004。室溫喂養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2方法

1.2.1實驗分組及ALD大鼠模型的制備 將100只健康雄性SD大鼠分為對照組、模型組、Rh1組、CK組、Rh1-CK組及PNS組6組，模型組和對照組每組10只，其余每組20只。除對照組外，每天清晨給予其余各組大鼠56度紅星二鍋頭-吡唑-玉米油混合液灌胃，其中玉米油的攝入量為(2 g·kg-1·d-1)，吡唑的攝入量為(24 mg·kg-1·d-1)，白酒量及營養(yǎng)液灌胃量根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化、毛色、活躍程度及死亡情況進(jìn)行調(diào)整。按上述方法喂養(yǎng)大鼠共16周后，抽取每組大鼠各2只，進(jìn)行眼眶靜脈采血檢測肝功能，采血后取肝臟組織做石蠟切片行HE染色，觀察肝脂肪變性程度及肝細(xì)胞形態(tài)變化情況，檢驗大鼠ALD模型的制備情況。

1.2.2藥物干預(yù) ALD模型制備成功后，大鼠每天清晨稱質(zhì)量，每組大鼠除繼續(xù)同1.2.1項下喂養(yǎng)以外，將(60 mg·kg-1·d-1)的人參皂苷Rh1、CK、Rh1∶CK=1∶1混合物及PNS溶于56度紅星二鍋頭-吡唑-玉米油混合液分別灌胃Rh1組、CK組、Rh1-CK組、PNS組大鼠，同時模型組和對照組給予等容量0.9%生理鹽水，治療時間為3周。

1.2.3動物處理 治療3周結(jié)束后，大鼠禁食不禁水1 h后，稱體質(zhì)量，于眼眶靜脈采血，用超速離心機離心血液，分離出血清，同時剖腹取肝臟組織，固定于2.5%戊二醛溶液。

1.2.4檢測指標(biāo) 觀察大鼠肝臟：用肉眼對所有大鼠肝臟的質(zhì)地和色澤等進(jìn)行觀察，并行肝臟HE染色，檢驗大鼠ALD模型的制備情況，比較各組大鼠肝臟脂肪變程度。用全自動生物化學(xué)分析儀檢測大鼠血清生物化學(xué)指標(biāo)：大鼠血清ALT、AST、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TB)、直接膽紅素(DB)及谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)。

1.2.5肝細(xì)胞電鏡標(biāo)本制作及讀片 由病理專業(yè)醫(yī)師制作電鏡標(biāo)本，將制作好的標(biāo)本編號登記后打亂，在JEM-1011型透射電鏡下對肝細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)、肝細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體進(jìn)行詳細(xì)觀察，選擇反差好、無污染及制片過程無損壞的部位進(jìn)行拍照，在低倍下拍攝肝細(xì)胞及間質(zhì)，高倍下拍攝肝細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體，電鏡攝片由病理專業(yè)醫(yī)師讀片。對線粒體的體視學(xué)分析要求高倍(30 000倍)下每組拍攝不少于30張照片[4]。體視學(xué)定量分析主要針對超微形態(tài)下線粒體進(jìn)行研究，選擇肝細(xì)胞質(zhì)為參照系。采用的體視學(xué)指標(biāo)有：體積密度(Vvm),為某一結(jié)構(gòu)的體積與其所在的參照系體積之比；比表面(Qm),為結(jié)構(gòu)成分的表面積與體積之比；面積密度(Svm),為某一膜結(jié)構(gòu)的面積與其所在的參照系體積之比；面數(shù)密度(Nam)，為單位面積參照系界面中包含的某種顆粒的截面數(shù)。將所攝拍的電鏡照片在HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)new下測得以下二維圖像上的線粒體初級參數(shù)：(1)截面積；(2)截面曲線長；(3)線粒體(截面)數(shù)。由以上二維參數(shù)計算出肝細(xì)胞線粒體的Vvm、Svm、Nam、Qm。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測水平比較 模型組大鼠的ALT、AST水平明顯高于對照組和各加藥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，Rh1-CK組大鼠ALP水平明顯下降(P<0.05)。各組大鼠膽紅素水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組大鼠肝組織HE染色觀察結(jié)果 肝臟HE染色顯示，對照組可見肝細(xì)胞排列整齊，以中央靜脈為中心，向周圍呈放射狀排列；模型組可見肝細(xì)胞排列紊亂，腫大變圓，細(xì)胞間隙變大，肝細(xì)胞含大量脂滴，中央靜脈缺如，可見大量膠原沉積于細(xì)胞間質(zhì)，大量炎性細(xì)胞浸潤；PNS組可見中央靜脈及肝細(xì)胞間質(zhì)受累，一定數(shù)量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞腫脹，含大量脂滴，一定量膠原沉積；Rh1組、CK組、Rh1-CK組大鼠肝臟HE染色改變介于對照組與模型組之間，肝細(xì)胞大致以中央靜脈為中心，向周圍呈放射狀排列，可見少量脂滴，細(xì)胞間質(zhì)可見少量炎性細(xì)胞浸潤，見圖1。

2.3各組大鼠肝組織的電鏡觀察結(jié)果 對照組大鼠肝細(xì)胞電鏡下觀察，見細(xì)胞核圓，核仁大，核膜清晰，核染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯；肝細(xì)胞內(nèi)有豐富的細(xì)胞器，可見大量核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，分布正常，脂滴少見，線粒體形態(tài)多為圓形或橢圓形，內(nèi)可見基質(zhì)顆粒，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈層狀排列；Disse間隙內(nèi)有豐富的微絨毛；毛細(xì)膽管內(nèi)無淤膽；Disse間隙內(nèi)無膠原纖維增生；肝細(xì)胞間隙稀疏，胞間偶見少量膠原纖維，肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠肝臟電鏡下見肝細(xì)胞內(nèi)大量大小不等的脂質(zhì)空泡變性，部分肝細(xì)胞質(zhì)水腫，線粒體可見增生肥大、腫脹，少數(shù)可見固縮，部分細(xì)胞內(nèi)線粒體殘體增多，基質(zhì)顆粒減少，甚至出現(xiàn)致密、邊界不清的絮狀物，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成囊狀擴張，并有脫顆粒；肝血竇可見淤血、擴張，Disse間隙變窄。PNS組大鼠肝臟電鏡下見與模型組相似，肝細(xì)胞內(nèi)見一定數(shù)量脂肪空泡變性，部分線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈囊狀擴張；可見肝血竇淤血、擴張；Disse間隙明顯增寬，微絨毛較多，膠原沉積減少；較模型組對ALD無明顯改善作用。Rh1組、CK組、Rh1-CK組各組內(nèi)大鼠肝臟電鏡觀察基本改變介于對照組與PNS組之間，見圖2。

2.4肝細(xì)胞線粒體體視學(xué)分析 以下照片數(shù)均為38張。Rh1組、Rh1-CK組及模型組Vvm較對照組明顯增高(P<0.05)；CK組、PNS組較對照組有所增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Rh1組、Rh1-CK組、PNS組及模型組Svm較對照組明顯增高(P<0.05)；CK組、Rh1組、Rh1-CK組、PNS組Svm較模型組明顯降低(P<0.01)。Rh1組、PNS組、模型組Nam較對照組明顯增高(P<0.01)；CK組、Rh1組、Rh1-CK組Nam較模型組明顯降低(P<0.05)。對照組大鼠Qm高于其他組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 各組大鼠肝功能檢測結(jié)果比較

a:P<0.05，與模型組比較；b:P<0.05，與對照組比較

A:對照組；B:模型組；C:Rh1組；D:CK組；E:Rh1-CK組；F:PNS組

A:對照組；B:模型組；C:Rh1組；D:CK組；E:Rh1-CK組；F:PNS組

表2 細(xì)胞線粒體體視學(xué)計量結(jié)果

a：P<0.05；b：P<0.01,與對照組比較；c：P<0.05；d:P<0.01，與模型組比較

3 討 論

ALD是我國最主要的慢性肝病之一，其主要由于長期大量飲酒所致。初期表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化[5]。來自世界衛(wèi)生組織(WHO)的報道稱，全球范圍內(nèi)約330萬的死亡由乙醇引起[6]。肝臟為乙醇代謝的主要場所，90%的乙醇在肝內(nèi)代謝，通過乙醇脫氫酶、微粒體氧化系統(tǒng)和過氧化氫酶等不同途徑而氧化為乙醛，乙醛又經(jīng)乙醛脫氫酶作用氧化成為毒性較低的乙酸鹽[7]，最終生成二氧化碳和水。乙醇及乙醛對肝細(xì)胞存在直接毒性作用，亦可誘導(dǎo)肝內(nèi)其他細(xì)胞、炎癥介質(zhì)等參與疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，乙醛也被視為導(dǎo)致ALD進(jìn)展的直接毒物中的關(guān)鍵組分[8]。在肝細(xì)胞受到內(nèi)外因素干擾時，線粒體反應(yīng)最早、變化最敏感、也最明顯，是決定細(xì)胞由可逆到不可逆改變的關(guān)鍵細(xì)胞器；多個研究表明，乙醇及其代謝產(chǎn)物對肝臟線粒體結(jié)構(gòu)、線粒體DNA的破壞及對其功能的影響，在脂肪肝發(fā)生機制中起到重要作用[9-10]。人參皂苷Rh1為人參皂苷Rg1、Re經(jīng)腸內(nèi)菌群代謝后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[11]，經(jīng)研究證實，人參皂苷Rg1具有抗氧化和抗肝纖維化作用[12]，可有效地降低異常升高的血清生化指標(biāo)，減輕線粒體嵴斷裂膜破壞，緩解肝臟損傷等病理改變[13]。人參皂苷CK為人參皂苷Rb1經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化作用的結(jié)果，其具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老的作用。本研究采用線粒體作為觀察指標(biāo)，并猜測對線粒體結(jié)構(gòu)與功能有作用的藥物對ALD所致的肝損傷可能有改善作用。本研究通過建立一個與人類酒精性肝損傷發(fā)展病變過程相似的動物模型以探索人參皂苷單體成分對改善酒精性肝損傷的作用機制。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh1、CK及Rh1∶CK混合物可降低ALD肝酶水平。ALT和AST是存在于肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性酶，肝細(xì)胞損傷后，細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致ALT、AST釋放入血，故血清ALT、AST水平高低可以反映肝細(xì)胞的損傷程度[14-15]。研究提示人參皂苷可能通過下調(diào)肝酶水平從而改善ALD的肝損傷，延緩ALD的進(jìn)展。人參皂苷Rh1∶CK還能降低大鼠ALP水平，但Rh1、CK對大鼠ALP無顯著作用，因此，可推測人參皂苷Rh1∶CK混合物保肝作用較強。此外，本研究中觀察到人參皂苷Rh1、CK及Rh1∶CK混合物明顯改善ALD中肝臟組織的病理改變。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)加藥處理后肝臟中脂肪沉積及炎性反應(yīng)較前緩解，以此延緩ALD進(jìn)展。最后，人參皂苷Rh1、CK及Rh1∶CK混合物可改善受損線粒體形態(tài)及結(jié)構(gòu)。在長期乙醇暴露過程中，肝細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞器活性均可受其影響，包括多重水平線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生、蛋白酶體活性減低、微管功能破壞等多個方面綜合作用。這其中，線粒體被視為乙醇毒性作用的關(guān)鍵靶點之一[7]。線粒體受損后其病理表現(xiàn)多樣，例如：細(xì)胞形態(tài)異常，水腫，嵴的數(shù)量減少、排列紊亂，以及晶體樣雜質(zhì)形成，內(nèi)膜的破壞和溶解，脂滴在周邊沉積等[16]。本實驗中，模型組小鼠肝臟線粒體形態(tài)各異，腫脹明顯，線粒體膜融合，基質(zhì)電子密度下降，嵴斷裂或消失，與上述報道相符。模型組Vvm、Svm、Nam均較對照組增高，提示線粒體結(jié)構(gòu)變化以腫脹或增生為主，此與電鏡下觀察結(jié)果一致。而加藥處理后各組中上述指標(biāo)較模型組降低，且數(shù)值介于模型組和對照組之間。由此證實，當(dāng)發(fā)生ALD時，肝細(xì)胞線粒體形態(tài)及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、功能受損，而人參皂苷相關(guān)成分可改善上述變化，恢復(fù)線粒體功能，從而起到減輕酒精性肝損傷的作用。

因以上兩種人參皂苷成分在天然人參中含量極少甚至不存在，批量制備成本較高，且工程化生產(chǎn)工藝不成熟，導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用方面受到限制，對其藥理、毒副作用方面的研究尚欠缺。由對人參皂苷其他單體成分的研究可知，其對神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、腫瘤等各方面均有影響[17]，在改善肝細(xì)胞損傷、抗肝纖維化方面亦有特殊作用。考慮其可能的作用機制：(1)減少機體脂肪酸合成，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6等的產(chǎn)生；(2)抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達(dá)，從而減輕肝臟炎癥反應(yīng)；(3)通過下調(diào)血小板衍生生長因子(PDGF)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞的活化與增殖延緩肝纖維化的發(fā)展等[18-19]。通過本研究進(jìn)一步證實人參皂苷Rh1及CK可降低肝酶水平、延緩肝細(xì)胞病理改變、減輕肝細(xì)胞脂肪變性程度及改善線粒體結(jié)構(gòu)與功能 ，其中又以人參皂苷CK作用最為明顯，其次為Rh1-CK，再次為人參皂苷Rh1。此結(jié)果可能為今后提取人參皂苷單體成分改善ALD患者酒精性肝損傷及臨床藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。