黃芪-葛根配伍對葛根素在2型糖尿病大鼠體內藥動學的影響

袁麗君，涂 星,2△，佟智斌，譚 紅，邱路雅，李 瑩

(1.湖北民族學院醫學院中醫藥系，湖北恩施 445000；2.風濕病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北恩施 445000)

黃芪-葛根為臨床常用對藥，起源于清代名醫李用粹的《證治匯補》卷三，以黃芪一兩、葛根五錢組成；后張錫純在《西學衷中參西錄》中的玉液湯選用黃芪五錢、葛根一錢半以治療消渴癥[1]；現代臨床常用于治療氣陰兩虛之高血壓、糖尿病和卒中后遺癥等[2]，尤其適用于糖尿病合并高血壓、冠心病和腦血管病變的患者[3]。王春怡等[4]研究發現該藥對通過降低糖尿病小鼠的空腹血糖、提高糖耐量、增加小鼠對胰島素的敏感指數和降低胰島素抵抗(IR)指數，同時下調血脂和血清中游離脂肪酸的水平，發揮治療糖尿病及IR作用。現代研究還證實，黃芪-葛根配伍對肝臟糖脂代謝、胃黏膜損傷、糖尿病腎病(DN)、糖尿病心肌病、神經根型頸椎病等都具有較好的治療或保護作用[5-9]。而黃芪-葛根以2∶1和3∶1的比例配伍是否對其主要有效成分葛根素的代謝存在影響，本研究擬通過對糖尿病大鼠體內葛根素的藥代藥動學研究，探討其體內動力學特征，為黃芪-葛根臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SD大鼠40只，SPF級，體質量(200±20)g，雌雄各半，購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2儀器 LC-2030C高效液相色譜儀(四元梯度高壓輸液系統、自動進樣系統、二極管陣列檢測系統等)購自日本島津公司，BSA224S-CW十萬分之一電子分析天平購自塞多利斯科學儀器北京有限公司，VX-200渦旋混合儀器購自美國Labnet公司，5810R高速低溫冷凍離心機購自德國eppendorf公司，Milli-Q超純水系統購自貝徠美生物科技有限公司，KQ2200E型超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司，BUCHI R-210旋轉蒸發儀購自瑞士步琦公司，低溫冰箱購自河南新飛電器集團有限公司。

1.1.3藥物與試劑 葛根、黃芪中藥飲片，購于恩施宏升大藥房，經湖北民族學院醫學院朱敏英教授鑒定分別來源于豆科植物甘葛藤PuerariathomsoniiBenth.的根和豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的根；葛根素對照品(批號：110752-201615)，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；水為去離子超純水；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.12型糖尿病(T2MD)大鼠模型的建立和分組 將SD大鼠40只適應性喂養1周后，隨機分為對照組(10只)和造模組(30只)。造模組采用腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，用pH4.2檸檬酸鈉緩沖液配制成0.25%(現配現用)，3 d后斷尾取血，用血糖儀檢測隨機血糖水平。以大鼠血糖大于或等于16.7 mmol/L為成功模型大鼠。對照組大鼠腹腔等量注射pH為4.2檸檬酸鈉緩沖液。結果造模成功大鼠26只，剔除血糖值過高(≥26.0 mmol/L)2只，將剩余24只大鼠隨機分為葛根組(黃芪葛根0∶1)、黃芪葛根A組(黃芪-葛根2∶1)、黃芪葛根B組(黃芪葛根3∶1)，每組8只。

1.2.2給藥、樣品采集和處理 按照黃芪-葛根不同配比(3∶1、2∶1、0∶1)，固定葛根用量，稱取藥材，加10倍量水煎煮1.5 h，濾過，濾渣加8倍量水煎煮0.5 h，濾過，合并兩次濾液，減壓濃縮至含生藥量1.0 g/mL。黃芪-葛根不同配比(3∶1、2∶1、0∶1)組禁食不禁水12 h后，分別灌胃給予相應的水煎液(給藥量折合葛根素為200 mg/kg)；對照組(8只)同法給予黃芪-葛根0∶1水煎液，另2只大鼠麻醉后腹主動脈采集空白血15份于1.5 mL抗凝管中。于給藥后0、2、5、10、15、20、30、45、60、120、180、240、300、360、420 min以肝素鈉浸泡過的毛細管眼球后靜脈叢采血0.3 mL于1.5 mL抗凝管中，于高速冷凍離心機中15 000 r/min離心15 min，分離血漿。精密移取分離的血漿100 μL于1.5 mL離心管中，加入400 μL乙腈-甲醇(1∶9，V/V)溶液，渦旋震蕩3 min，于高速冷凍離心機15 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.2.3高效液相色譜法(HPLC)檢測血漿中葛根素水平分析方法建立 (1)色譜條件：色譜柱為SinoChrom ODS-BP柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸(35∶65)；流速1.0 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。(2)適用性實驗：在該色譜條件下，取對照品溶液(1 000 μg/mL)、供試品溶液和空白血漿，分別按照上述色譜條件進樣，考察待測峰的保留時間、分離度和理論塔板數。

1.2.4標準曲線溶液配制 精密稱取置于P2O5中干燥至恒質量的葛根素標準品10 mg，加30%甲醇溶解并定容至10 mL，即得1 mg/mL對照品儲備液，50、100、200、400、600、1 000、2 000、3 000 μL于10 mL容量瓶，加30%乙醇定容刻度，即得系列濃度的對照品溶液。

1.2.5精密度實驗 取1.2.4項下5、20、100 μg/mL的葛根素對照品溶液，按1.2.3項色譜條件重復進樣6次，測定峰面積計算穩定性相對標準偏差(RSD)。

1.2.6穩定性實驗 分別取葛根組及黃芪葛根A、B組10 min時的供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h后按1.2.3項下色譜條件分別進樣3次，測定峰面積，以平均峰面積計算穩定性RSD。

1.2.7回收率實驗 另取正常大鼠空白血9份分為3組，分別加入葛根素標準品1、2、4 mg，于高速冷凍離心機中15 000 r/min離心15 min，分離血漿，精密移取分離的血漿100 μL于1.5 mL離心管中，加入400 μL乙腈-甲醇(1∶9，V/V)溶液，渦旋震蕩3 min，于高速冷凍離心機中15 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，按1.2.3項下進樣，計算平均回收率。

1.2.8解凍-凍融穩定性實驗 分別取葛根組及黃芪葛根A、B組10 min時的供試品溶液，置于-18 ℃冰箱中存放6 h，室溫放置解凍，循環3次后，按1.2.3項下色譜條件分別進樣3次，測定峰面積，以平均峰面積計算穩定性RSD。

1.2.9藥物動力學(PK)模型的擬合 采用PKsovler軟件繪制藥-時曲線，對各組大鼠血漿中葛根素的血藥濃度-時間關系進行PK房室模型擬合，以Akaikei′s信息量準則值(AIC)、殘差平方和值(RSS)、擬合度決定系數(R2)指標篩選最佳房室模型(RSS越小，R2越大，AIC越小表明所建立的模型越佳)，輸出PK相關參數。

2 結 果

2.1各組血漿中葛根素水平 在HPLC條件下，葛根素的保留時間約為3.95 min，分離度R>1.5，理論塔板數以葛根素計不少于4 000，表明血漿樣本中葛根素分離度良好，空白血漿其他成分無明顯干擾。各組血漿中葛根素水平，見圖1。

A:葛根對照品溶液;B:空白血漿;C：葛根單煎液血漿樣品供試液;D：黃芪-葛根配伍血漿樣品供試液

2.2標準曲線的制備 將對照品溶液按1.2.3項下色譜條件進行測定，以對照品溶液濃度(μg·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果求得回歸方程為Y=66 448.986 7X-175 666.002 4，相關系數r=0.999 6，表明葛根素在5～300 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.33組供試品精密度實驗結果 葛根組及黃芪葛根A、B組RSD分別為0.671%、0.293%、1.414%，表明儀器精密度良好。

2.43組供試品穩定性實驗結果 葛根組及黃芪葛根A、B組RSD分別為2.612%、2.791%、2.592%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.53組供試品回收率實驗結果 葛根組及黃芪葛根A、B組平均回收率分別為96.14%、97.22%、99.04%，RSD分別為2.65%、2.69%、2.45%，表明回收率良好。

2.63組供試品解凍-凍融穩定性實驗結果 葛根組及黃芪葛根A、B組RSD分別為1.06%、1.10%、0.98%，表明反復冷凍、融化對樣品無明顯影響。

2.7PK模型的擬合 各組大鼠血漿中葛根素的血藥濃度-時間關系經擬合，綜合考慮RSS、R2和AIC，確定葛根素的最佳房室模型均為一室模型，結果見表1；其藥-時曲線見圖2，其PK參數見表2。對照組大鼠灌胃給予葛根水煎液后，葛根素在其體內的吸收較快，而在糖尿病大鼠體內的吸收會減緩(P<0.05)、消除時間和達峰時間(Tmax)延長(P<0.05)，0～420 min生物利用度(AUC0-420)、時間曲線下面積(AUMC)、平均滯留時間(MRT)均明顯增加(P<0.05)，表觀分布容積(V/F)和表觀清除率(CL/F)無明顯性差異。在糖尿病大鼠中，與黃芪葛根0∶1比較，黃芪-葛根以2∶1和3∶1比例配伍時，葛根素體內吸收速率加快(P<0.05)，而消除時間、V/F、CL/F、AUC0-420、AUMC、MRT均明顯增加(P<0.05)，但Tmax和高峰濃度(Cmax)差異無統計學意義(P>0.05)，且黃芪-葛根以3∶1比例配伍時上述指標變化更明顯(P<0.05)。

表1 各組大鼠葛根素的藥動學隔室模型判斷指標

表2 各組大鼠血漿中葛根素的房室模型PK參數

續表2 各組大鼠血漿中葛根素的房室模型PK參數

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與葛根組比較；c:P<0.05,與黃芪葛根A組比較

A:對照組(葛根-黃芪0∶1);B:葛根組;C:黃芪葛根A組;D:黃芪葛根B組

3 討 論

糖尿病是由于胰島素分泌缺乏和(或)胰島素生物效應受損而引起的以慢性高血糖為主癥，同時伴有脂肪、蛋白質、水和電解質紊亂的代謝性疾病，屬于中醫“消渴證”范疇。黃芪和葛根是治消渴古方中配伍的常用藥味，其中黃芪“甘溫益元氣，甘溫除大熱，故通主之；氣旺則津液生，故止渴”。而葛根“治脾胃虛而渴，除胃熱，善解酒毒，通行足陽明經之藥”，故常作為藥對使用。

現代研究發現，黃芪-葛根藥對在糖尿病上廣泛使用，對其并發癥諸如DN、糖尿病心肌病、糖尿病IR、糖尿病肝病等具有較好的治療作用[10-12]，且對胃黏膜損傷具有一定的保護作用[6]。而葛根素為葛根干燥根莖提取的一類黃酮化合物，研究表明葛根素具有改善高血糖導致的心肌細胞損傷，維持心室肌細胞的功能，保護視網膜神經元以延緩糖尿病大鼠視網膜病變等作用[13-14]。

本研究發現，葛根素在健康大鼠和糖尿病大鼠體內的藥動學行為存在明顯差異。與健康大鼠比較，葛根素在糖尿病大鼠體內的吸收半衰期、消除半衰期和Tmax延長(P<0.05)，AUC0-420、AUMC、MRT明顯增加(P<0.05)，表明葛根素在糖尿病大鼠體內的生物利用度增加，MRT更長，提示在糖尿病患者服用葛根素時應注意給藥間隔，避免藥物蓄積引起不良反應。

此外，本研究發現黃芪-葛根以0∶1、2∶1和3∶1比例配伍時，葛根素在糖尿病大鼠體內的藥動學行為均存在明顯差異。主要表現為黃芪-葛根配伍使用時相對于單用葛根吸收半衰期和Tmax明顯縮短(P<0.05)，CL/F明顯降低(P<0.05)，而消除半衰期、V/F、AUC0-420、AUMC、MRT均明顯增加(P<0.05)，吸收半衰期和Tmax的縮短提示二者配伍后可有效加快葛根素的吸收，快速發揮治療作用；而AUC0-420、AUMC的增加提示二者配伍后增加了葛根素的生物利用度，可能提高了治療糖尿病效果；MRT和消除半衰期的延長提示二者配伍后葛根素在體內的代謝時間延長，有助于延長藥效作用時間。該結果提示黃芪與葛根配伍增效的作用機制可能與黃芪改變葛根藥動學參數有關。

本研究中發現，黃芪-葛根以2∶1、3∶1比例與0∶1比例配伍時比較，葛根素吸收Cmax、半衰期、Tmax、CL/F、消除半衰期等均有明顯變化，提示黃芪可以延長葛根素在大鼠體內吸收半衰期，從而增加葛根素的治療時間。黃芪-葛根以0∶1、2∶1和3∶1比例配伍時Cmax及Tmax均無明顯差異，表明葛根素在體內吸收可能具有飽和現象，提示其在體內的吸收可能除了被動吸收外，還存在主動轉運和易化擴散等多種方式。黃芪-葛根以3∶1比例配伍時消除半衰期、V/F、AUC0-420、AUMC、MRT等參數的變化較黃芪-葛根2∶1配伍時變化更明顯(P<0.05)，證實了黃芪-葛根的配伍比例可影響葛根素在體內的藥動學行為。

綜上所述，本研究從藥動學行為上驗證了黃芪-葛根以2∶1和3∶1的比例配伍時與單用葛根時體內藥動學行為存在明顯差異，二者配伍時黃芪可有效提高葛根素在大鼠體內的生物利用度，減緩消除時間，延長藥物作用時間而達到協同增效的目的。