γ-CGTase突變體制備及其產γ-CD條件優化

王金鵬 ， 王 萍 ， 苑 征 ， 李林林 ， 范浩然 ， 金征宇

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3.食品安全與營養協同創新中心，江南大學，江蘇 無錫214122）

環糊精（cyclodextrin，簡稱CD）是由環糊精葡萄糖基轉移酶 （cyclodextrin glycosyltransferase，簡稱CGTase）酶解淀粉或者淀粉類似物產生的由D-吡喃型葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的一類環狀低聚化合物[1-3]。與α-CD、β-CD相比，γ-CD具有獨特的性質：首先，γ-CD具有較大的空腔和較高的溶解度，能夠包埋較大的客體分子從而增加其溶解度，進而改變它們的理化性質；其次，γ-CD安全性高，可以被人體內的唾液淀粉酶和胰異淀粉酶迅速消化[4-5]，因此，γ-CD在人體小腸內可以迅速的降解和吸收[6-7]，但α-CD、β-CD則不能。并且γ-CD的高生物利用度使得其在食品和醫藥領域有著特殊的應用。

影響γ-CD產率及產物專一性的因素有很多，主要包括CGTase的來源及其酶學特性，反應條件如反應時間、反應溫度、底物濃度、底物種類、有機溶劑種類及含量等的影響。曹新志等[8]以質量分數5%的馬鈴薯、玉米、木薯、甘薯、焦藕淀粉為底物，加入質量分數2%的甘草酸和適量的CGTase酶液，于60℃反應12 h，結果表明以木薯淀粉和焦藕淀粉為底物時γ-CD轉化率最高；Rendleman等人[9]利用Bacillus sp.AL6生產γ-CD時，當底物質量分數由2.5%增加到6%時，γ-CD的轉化率卻由35%降到了21%。Kyoko等人[10]研究發現改變反應的pH，也會使環糊精種類所占比例發生改變。還有研究表明，在低溫及有機溶劑存在的條件下，更有利于提高環糊精的轉化率，因為低溫條件下環糊精-有機溶劑復合物更加穩定，易于將環糊精從反應體系中沉淀出來，使酶反應向著正方向進行[11-12]。

作者所用γ-CGTase來自于Bacillussp.G-825-6，據報道該酶催化淀粉不產生α-CD，僅產生β-CD和γ-CD。作者依據參考文獻，對該酶位于-7亞位點附近的211位氨基酸（酪氨酸）進行了定點突變，研究了突變體Y211L催化淀粉產γ-CD的條件，對于降低γ-CD的生產成本和推動γ-CD的工業化生產具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

質粒 pET-20b （+）/γ-cgt： 德國萊比錫大學Zimmermann教授提供；克隆宿主E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）：購于南京百斯凱科技有限公司。

可溶性淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、酵母粉、胰蛋白胨、氯化鈉、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、氨芐、三羥甲基氨基甲烷等：購自國藥集團。

高速冷凍離心機（BIOFUGE PRIMOR）：美國Thermo Scientific有限公司產品；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1900）：北京普析通用儀器有限責任公司產品；高效液相色譜儀（LC-20AT230V）、示差折光檢測器 （RID-10A）、AKTA purifier900蛋白純化系統：島津公司產品；Hypersil NH2色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 mAPS-2Hypersil 微 粒 ）： 美 國Thermo公司產品；純泰Ni-NTA親和層析柱：GE Healthcare life sciences公司產品；ShodexOHpak SB-804 HQ和OHpak SB-802.5 HQ色譜柱：日本昭和公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 突變體的構建 以質粒 pET-20b（+）/cgt為模板，設計一對互補引物，采用一步PCR法突變CGTase基因中的相應位點，設計引物如下：

正向引物：5’-ATC GAAATCTTCTTGATTTAG CTAGT-3’，

反 向 引 物 ：5’ -GACTAGCTAAATCAAGAA GAT TTC GAT-3’，

PCR反應體系為：DNA模板10～100 ng，正向突變引物（10 μmol/L）1 μL，反向突變引物（10 μmol/L）1 μL，5×Reaction Buffer10 μL，Fast Alteration DNA Polymerase（2.5 U/μL）1.5 μL，用滅菌的雙蒸水補充至 50 μL。

質粒DNA的提取按照Thermo Scientific公司的質粒小提試劑盒說明書提取。

PCR擴增條件為：預變性（95℃）3 min；變性（95 ℃）30 s，退火（55 ℃）30 s，延伸（72 ℃）3 min，共30個循環；延伸（72℃）5 min，冷卻至 4℃。

取PCR產物50 μL加入20 U/μL的限制性內切酶DpnI 1 μL，充分混勻后將該酶切體系于37℃條件下消化1 h。

將酶切后的產物轉化至宿主菌中，具體步驟如下：從-80℃冰箱中取出感受態細胞E.coli DH-5α置于冰上解凍；取45 μL剛剛解凍好的感受態細胞和5 μL DpnI消化產物放于提前預冷好的2 mL無菌離心管中，用槍頭輕柔吹打混勻，繼續冰浴30 min；將試管放到42℃水浴鍋中，準確熱激60 s，立即置于冰上5 min；加入500 μL預熱的無菌的LB培養基（不含Amp），混勻后置于37℃搖床以200 r/min振蕩培養1.5 h，使菌體復蘇；培養結束后，5 000 r/min離心5 min，去掉上清液400 μL。將余下的感受態細胞涂布在含有Amp的LB固體瓊脂培養基上，將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養12～16 h。

挑取LB平板上的單菌落接種至含有100 μg/mL Amp的LB液體培養基中，置于37℃恒溫搖床中以200 r/min振蕩培養10 h，然后提取質粒、酶切，DNA瓊脂糖凝膠電泳驗證，將驗證正確的質粒送至上海生物工程公司測序鑒定。將測序正確的質粒轉化至E.coli BL21（DE3），挑取單菌落接種至含有 100 μg/mL氨芐青霉素鈉的LB液體培養基中，置于37℃恒溫搖床中以200 r/min振蕩培養過夜，保藏菌種即得到含有突變質粒的基因工程菌，將該基因工程菌置于-80℃冰箱中保藏。

1.2.2 Y211L/γ-CGTase 的制備、純化

1）溶液配制方法 LB培養基配制：取胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g，加入去離子水1 L，攪拌均勻后分裝，于高壓滅菌鍋內121℃滅菌15 min；IPTG溶液制備：準確稱取1.19 g異丙基-β-D-硫代半乳糖苷置于10 mL燒杯中，加入少量無菌水溶解后，轉移至滅菌的5 mL容量瓶中定容，分裝后于-18℃下保存；氨芐溶液配制：準確稱取1 g氨芐置于10 mL燒杯中，加入少量無菌水溶解后，轉移至滅菌的10 mL容量瓶中定容，分裝后于-18℃下保存；Tris-HCl溶液配制：取6.05 g三羥甲基氨基甲烷置于1 L的燒杯中，加入1 L去離子水溶解，滴加鹽酸用pH計調pH至0.85，后置于4℃冰箱保存。

2）環糊精糖基轉移酶的制備方法 從冰箱中取出甘油管保藏菌接種至含有50 mL LB培養基的250 mL的錐形瓶中，在37℃、200 r/min條件下振蕩培養10 h。

按體積分數4%的接種量接種至含有100 mL培養基的500 mL的錐形瓶中培養，在600 nm下測定吸光度，待A600nm=0.6～0.8時加入IPTG使其終濃度為0.05 mmol/L，后在18℃、200 r/min下誘導培養16 h。培養結束后，菌液在5 000 r/min離心30 min，棄掉上清液，收集菌體。將菌體懸浮于pH 8.5的Tris-HCl中進行超聲破碎，離心后所得上清液即粗酶液。

3）環糊精糖基轉移酶的純化方法 粗酶液純化采用淀粉吸附法。向粗酶液中按質量分數5%加入玉米淀粉，然后加入硫酸銨使其終濃度為1 mol/L，在4℃下緩慢攪拌1 h，使酶充分被淀粉吸附；反應結束后將混合物5 000 r/min離心15 min，沉淀用預冷的1 mol/L的硫酸銨洗滌除去未被吸附的蛋白質，離心后取沉淀；將沉淀用含有1 mmol/L γ-CD的50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl在37℃下振蕩混合30 min離心后得到洗脫液1，將剩余沉淀再用同樣的含有γ-CD的緩沖液洗脫，得到洗脫液2；將兩次洗脫液合并，用50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl緩沖溶液在4℃透析24 h，每隔8 h換一次緩沖溶液。

1.2.3 γ-CD標準曲線測定方法 稱取0.4 g γ-CD，用少量超純水溶解后定容至100 mL，配制成4 mg/mL的標準溶液。取標準溶液分別稀釋至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL，取適量稀釋液過膜用高效液相色譜法測定繪制標準曲線，測定條件為流動相體積分數70%乙腈，流量1 mL/min，溫度40℃，進樣量 20 μL。

1.2.4 酶活測定 配制質量分數2%的可溶性淀粉為底物，取900 μL底物于2 mL離心管中加入100 μL酶液，置于酶反應器上反應50℃，800 r/min反應半小時后取500 μL沸水浴中滅活10 min，測定。剩余的500 μL繼續反應半小時后煮沸滅活，測定。

測定方法：以γ-CD的轉化率為指標采用高效液相色譜法進行分析。取反應液500 μL加入500 μL乙腈10 000 r/min離心10 min取上清液過膜，進行測定分析，分析條件為流動相體積分數70%乙腈，流量 1 mL/min，溫度 40 ℃，進樣量 20 μL。

酶活定義：上述方法，每30 min生成1 mmol的γ-CD需要的酶量為一個酶活單位。

1.2.5 催化條件優化方法

1）單因素實驗 以γ-CD的轉化率為指標分別考察底物種類、底物濃度、加酶量、反應時間對CGTase催化淀粉分解的影響。

分別取玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉做為底物，加入去離子水加熱糊化，制成質量分數為1%的溶液，冷卻到室溫，取1 mL底物加入適量CGTase，置于恒溫震蕩混勻器上反應24 h，結束后沸水浴滅酶10 min。取500 μL反應液加入500 μL乙腈10 000 r/min離心10 min后過膜，采用HPLC對γ-CD含量進行測定。測定方法與2.3.2中相同。

取最適底物，分別配制質量分數為1%、3%、5%、7%的溶液，加熱糊化后冷卻到室溫，取1 mL底物加入適量CGTase，置于恒溫震蕩混勻器上反應24 h，結束后沸水浴滅酶10 min，取500 μL反應液加入 500 μL乙腈 10 000 r/min離心 10 min后過膜，采用HPLC對γ-CD含量進行測定。測定方法與2.3.3中相同。

選取最佳底物配制成最佳質量分數的溶液，加熱糊化后冷卻到室溫，取1 mL底物分別加入2、4、6、8、10 U/g的CGTase，置于恒溫震蕩混勻器上反應24 h，結束后沸水浴滅酶10 min，取500 μL反應液加入 500 μL乙腈 10 000 r/min離心 10 min后過膜，采用HPLC對γ-CD含量進行測定，測定方法與2.3.3中相同。

2）正交設計實驗 在單因素實驗的基礎上選取底物質量分數、加酶量、反應時間3個因素，進行正交實驗，選用正交表L9（33）對CGTase的催化淀粉分解條件進行優化，實驗結果采用Minitab16軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 突變體的驗證

用DNAman對目的基因堿基序列和突變后的堿基序列進行比對，發現目的基因中的酪氨酸Y（TAT）成功突變成了亮氨酸 L（CTT），結果見圖 1。

圖1 突變前后基因的堿基序列比對圖Fig.1 Base sequence alignment for the gene before and after mutation

2.2 γ-CGTase（Y211L）催化淀粉條件探索

2.2.1 底物種類對催化反應的影響 由圖2可知，γ-CGTase（Y211L）催化淀粉的反應中，不同的反應底物對γ-CD的得率影響較大。其中木薯淀粉為底物時γ-CD的得率最高，馬鈴薯淀粉和可溶性淀粉為底物時γ-CD的得率較小。推測其原因是，不同來源的淀粉其直鏈淀粉/支鏈淀粉的比例不同，且分子量大小存在很大差異，這將影響γ-CGTase（Y211L）催化作用，進而造成不同的環糊精產率。

2.2.2 底物質量分數對催化反應的影響 由圖3可知，隨著底物質量分數的增加，γ-CGTase（Y211L）催化淀粉產生γ-CD的質量濃度先增加后減少，質量分數為5%時γ-CD的質量濃度達到最大，推測原因可能是由于低濃度時，酶催化反應較徹底，體系中小分子濃度較高，加劇了CGTase的偶合和環化作用，造成了較低的環糊精含量，隨著底物質量分數的升高，反應向環化方向偏移，但底物質量分數過高時，造成兩個或兩個以上的底物分子占據酶蛋白的活性位點，這可能會形成無活性的中間產物，使酶活性受到抑制。而且，底物質量分數過高，體系黏度較大，底物流動性減小，使酶無法與底物充分接觸，減弱 γ-CGTase（Y211L）的環化作用。

圖3 底物質量分數對催化反應的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on catalysis

2.2.3 加酶量對催化反應的影響 如圖4可知，CGTase催化淀粉反應隨加酶量的增加γ-CD的產量先增加后減少，在4 U/g時γ-CD的產量最大，因此加酶量選取4 U/g。

γ-CD產量隨加酶量先增加后減少，可能是由于加酶量過少時，反應緩慢；加酶量過高時，酶催化反應較徹底，環糊精降解，體系中小分子濃度較高。

圖4 加酶量對催化反應的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on catalysis

2.2.4 反應時間對催化反應的影響 如圖5可知，γ-CGTase（Y211L）催化淀粉反應隨反應時間的增加γ-CD的產量不斷增加，在24 h之前增加較快，24 h之后增加緩慢。出現這種現象可能是由于，在反應開始階段，體系中長鏈底物較多，利于環化反應進行，因此γ-CD的產量增加較快。但隨著反應時間的延長，體系中產物不斷增加，競爭性產物抑制作用加強，環化反應活性降低；同時，可能由于小分子濃度的增加，促進了CGTase的偶合和歧化作用，因而導致反應速率下降。

圖5 反應時間對催化反應的影響Fig.5 Effect of time on catalysis

2.3 γ-CGTase（Y211L）催化淀粉條件優化

以單因素探索的底物質量分數、加酶量、反應時間這3個因素對γ-CD產率的影響為依據，進行3因素、3水平的正交實驗設計，因素水平表如表1所示，正交實驗結果如表2所示。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

由表2可知，CGTase催化淀粉分解的最佳參數為A3B1C1，因素對試驗結果的影響順序為A＞B＞C，所以CGTase催化淀粉分解的最佳條件為：反應底物木薯淀粉，質量分數6%，加酶量4 U/g，反應時間24 h，反應溫度50℃。

表2 正交結果和分析Table 2 Results and analysis of orthogonal

2.4 γ-CGTase（Y211L）催化淀粉產物的分析

在同樣的催化條件下，原始的γ-CGTase催化淀粉后產物的HPAEC測定圖如圖6（a）所示，突變體Y211L的催化產物圖如圖6（b）所示，由圖可以看出，突變體Y211L催化生成的環糊精中γ-CD明顯提高，表明突變體具有良好的催化專一性，該研究能為γ-CD的工業化生產提供參考。

3 結 語

γ-CGTase（Y211L）是一種多功能酶，它能夠通過環化反應催化淀粉轉化為環糊精。目前對于CGTase催化淀粉產物的研究主要集中于產α-CD、β-CD，對γ-CD的研究較少。但是γ-CD具有較高的溶解性，同時其空腔也較大，具有較好的應用前景。作者構建了γ-CGTase突變體Y211L，從單因素實驗、正交實驗進行了制備γ-CD的條件優化，在適當的反應條件下提高了γ-CD的產量，對以后γ-CD產量的提高及其應用具有一定參考價值。